高效毛細(xì)管電泳測定納米抗體親和力

張騰飛，韓雪容，李飛，于建立，宋海鵬

（1.長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022；2.深圳市國創(chuàng)納米抗體技術(shù)有限公司，深圳 518000；3.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，青島 266101）

毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）又常被稱為高效毛細(xì)管電泳，主要是指在毛細(xì)管中，以高壓直流電場為驅(qū)動實現(xiàn)分離的新型液相分離技術(shù)［1］。其主要包括電腦終端控制系統(tǒng)、軟件數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)、壓力進(jìn)樣檢測系統(tǒng)和檢測器［2］，電泳遷移和電滲流是CE實現(xiàn)分離的主要因素。電泳遷移指在緩沖體系中帶電物質(zhì)電泳速度。電泳遷移率與顆粒所帶電荷量成正比，與電泳物質(zhì)的半徑和緩沖液體系濃度成反比。電滲遷移指在毛細(xì)管管壁上的硅羥基發(fā)生解離，使管壁帶有正電離子，使得管壁和緩沖溶液都形成電層，在有電流通過時，帶有正電荷的液體會向負(fù)極流動，如此就形成了電滲流［2-3］。攜帶正電離子和電滲流移動方向相同，攜帶負(fù)電離子的移動與之相反，正離子速度快所以最先流出，而負(fù)電離子只能依靠電泳速度流出，因此速度較慢。如此，帶有正負(fù)不同的帶電粒子因遷移速率不同，而實現(xiàn)了分離［4］。毛細(xì)管電泳容易上手操作，分離效率高，分析速度快，樣品損耗少，因此廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等專業(yè)領(lǐng)域。

納米抗體（Nanobody，Nb）由一個重鏈可變區(qū)和兩個常規(guī)的CH2區(qū)與CH3區(qū)組成［5］。納米抗體分子量小，大約10～20 kD之間［4］，直徑2.5 nm，長4 nm［6］。納米抗體有非常高的生物活性和親和力，因此，它和傳統(tǒng)抗體在抗原表位在結(jié)合上，具有無法比擬的亮點(diǎn)［7-8］。另一方面，納米抗體在獲得上比較容易，可以通過酵母菌上罐發(fā)酵的方式，大批量發(fā)酵得到［9］。在一定程度上大大減少了抗體制備的科研經(jīng)費(fèi)支出，為納米抗體未來制備進(jìn)入動物實驗和后期的臨床奠定了基礎(chǔ)［10］。

抗體穩(wěn)定性重要指標(biāo)之一就是抗原抗體親和力。在B淋巴細(xì)胞內(nèi)，受抗原刺激分泌形成抗體?？乖贵w親和力在一定程度上可以反應(yīng)出機(jī)體對于外界各種有害物質(zhì)的抵抗能力［11］。納米抗體抗原的親和檢測以及探究采用毛細(xì)管電泳新方法測定親和力都有重要的意義。

目前，常用的親和力常數(shù)的測定方法，如Biacore檢測，平衡透析、競爭結(jié)合、硫氰酸鹽洗脫法、ELISA和固相放射免疫測定法（SPRIA）等。在日常實驗中，Biacore檢測和ELISA是較為簡易常用的檢測方法。此類方法靈敏，客觀，是目前國內(nèi)比較流行的檢測方法［12-14］。尚未發(fā)現(xiàn)采用高效毛細(xì)管電泳的方式測定納米抗體親和力的方法，本文旨在采用高效毛細(xì)管優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，對納米抗體親和力測定，找到新的測定納米抗體親和力的方法。

1 材料與實驗

1.1 儀器與試劑

Beckman毛細(xì)管電泳儀PA800，32 Karat software色譜工作站（美國Beckman公司）；OKD-6501型酸度計（歐克儀表科技有限公司）；SPX6201電子天平（美國OHAUS）；未涂層石英毛細(xì)管（河北永年銳灃色譜器件有限公司）；0.22 μm濾膜（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；BNX-1200超聲波清洗器（濟(jì)南比能信電氣有限公司）。

聚乙烯六甲基溴（分析純，sigma-aldrich）、乙烯基磺酸（分析純，sigma-aldrich）、氫氧化鈉（分析純，sigma-aldrich）磷酸二氫鈉、磷酸一氫鈉（分析純，天津市化學(xué)試劑三廠）；抗體、抗原（深圳市國創(chuàng)納米抗體有限公司）。

1.2 溶液的配置

精確量取聚乙烯1.0 g用純水配成10 ml溶液；精確量取乙烯基磺酸1.0 g用純水配成100 ml溶液；精確量取氫氧化鈉2.0 g用純水配成50 ml溶液；精確量取磷酸二氫鈉4.68 g、磷酸一氫鈉16.39 g分別用純水配成100 ml溶液。使用時，只需將二者按照不同比例混合可得pH6.7～9.1范圍的緩沖液。將一定濃度的抗原抗體混合，在37℃條件下孵育30 min，達(dá)到一個穩(wěn)定平衡狀態(tài)備用，以上溶液配制完成后過0.22 μm濾膜并經(jīng)過超聲除氣泡處理，并在4℃儲存。

1.3 實驗操作

為了提高遷移時間和峰面積的重現(xiàn)性，裸管在使用前需要經(jīng)過清洗和活化過程。每次在使用儀器前，為保證毛細(xì)管管路的通暢，純水、緩沖液按照活化沖洗順序各沖洗10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收光譜

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水稀釋到一定的濃度，在波長為200～400 nm的紫外下進(jìn)行掃描，最后發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品在220 nm附近有較強(qiáng)的吸收，并將其作為最佳檢測波長。

2.2 電泳操作條件

本實驗的石英毛細(xì)管為未涂層的裸管，首先必須經(jīng)過進(jìn)行活化處理過程，在20 p條件下，按照活化過程，分別用1M Na0H沖洗管道30 min，去離子水沖洗管道15 min，電解質(zhì)溶液沖洗管道20 min，完成裸管活化過程。實驗操作在壓力為0.5 psi，電壓為25 kV，溫度為25℃的條件進(jìn)行。

2.2.1 緩沖溶液濃度的選擇

緩沖鹽的濃度直接影響到電泳介質(zhì)的離子強(qiáng)度，是關(guān)系電泳實驗成敗的關(guān)鍵因素之一。本實驗采用pH=7中性的條件下，考察不同濃度緩沖液對和測定效果的影響，結(jié)果如圖1所示。圖中緩沖溶液的濃度分別為：A為30 mM；B為50 mM；C為70 mM；D為100 mM。由圖可以看出，在50 mM條件之后，隨著緩沖液濃度的增加，遷移時間也在不斷延長，這主要是因為隨著緩沖液濃度的不斷增加，電滲流減小，遷移時間也在不斷延長。并且峰形隨濃度升高逐漸變寬，峰高而降低，主要由于緩沖液濃度過高，產(chǎn)生了較大的電流，提高了緩沖液體系的溫度，使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，峰形發(fā)生變化。在濃度為50 mM的條件下，時間較短且峰形較佳。因此，本文選擇最佳的緩沖溶液濃度為50 mM。

圖1 緩沖溶液濃度影響變化圖

2.2.2 緩沖溶液pH的選擇

電滲流和遷移時間都受pH的影響，因此不同樣品需要不同的pH電泳條件。本實驗是在背景電解質(zhì)濃度為50 mM條件下，分別考察了緩沖液pH為6、7和8時，分析不同pH條件下對實驗結(jié)果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 緩沖溶液pH影響變化圖

圖中緩沖溶液的pH值分別為：A的pH值為6、B的pH值為7、C的pH值為8。隨著pH的不斷增加，遷移時間也在逐漸延長。當(dāng)pH=8時，峰形逐漸變寬，峰高也明顯降低，說明在堿性條件下，結(jié)合物的穩(wěn)定性降低，容易發(fā)生解離現(xiàn)象，峰形明顯變差。當(dāng)pH=6時，檢測時間太短，兩個峰會發(fā)生重合，這是因為在酸性條件下抗體帶負(fù)電，容易和管壁發(fā)生吸附，從而無法達(dá)到理想的效果。因此，本實驗采用pH為7的結(jié)果。中性緩沖液條件下，有利于抗原抗體的結(jié)合，結(jié)合物較多，處于游離態(tài)的抗原少。

2.2.3 運(yùn)行電壓的選擇

在毛細(xì)管檢測中，分離電壓也是影響電滲流的重要因素之一，因此也將其為優(yōu)化的目標(biāo)。本實驗在固定濃度為50 mM的條件下，實驗分析電壓分別為25 V、20 V、15 V時對抗原抗體遷移時間的影響，結(jié)果如圖3所示。圖中的分離電壓分別為：A為25 KV、B為20 KV、C為15 KV。在25 KV條件下，由于電壓較高，遷移時間較短，抗原抗體分離效果較差。在15 KV條件下，電壓較低，明顯可以觀察到分析的時間延長。時間的增加，使樣品管壁吸附的可能性增加。分析時間的延長，同樣會使緩沖液溫度和pH發(fā)生變化，溫度較高條件下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，穩(wěn)定性變差，峰形變差。在電壓為20 KV時，遷移時間較短，峰形也較窄，清晰可辨。因此，本文選擇最佳的電壓是20 KV。

圖3 緩沖溶液電壓影響變化圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

配置濃度為0.1 nM、0.2 nM、0.3 nM、0.4 nM、0.5 nM的抗原溶液，在最佳緩沖液條件下進(jìn)行電泳，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示，曲線方程為y=85 110x+8 375（R2=0.990 3）。

圖4 抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線

配置濃度為0 nM、2 nM、4 nM、6 nM、8 nM、10 nM的抗體，分別和0.1 nM的抗原等體積混合，過濾震蕩進(jìn)樣。結(jié)果如圖5所示，顯而易見，抗體的峰面積在加樣抗體濃度的不斷增加情況下不斷增大，抗原峰面積明顯減小。

圖5 納米抗體抗原結(jié)合電泳圖

將游離抗原峰面積的變化記錄備用，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得游離抗原濃度。配體分離法公式為：

式中，[DP]表示結(jié)合物濃度；[P]表示游離蛋白濃度；[D]為游離抗原的濃度；r表示結(jié)合物相對于抗體的總量的比例；n為結(jié)合位點(diǎn)；Kb為抗原抗體結(jié)合常數(shù)［15］。求得Scatchard方程式為：

以r/［D］對r作圖，繪制抗原抗體Scatchard的結(jié)合曲線，如圖6，所得曲線方程為y=-4.874 7x+1×109，由斜率的到抗原抗體的結(jié)合常數(shù)4.87×109M-1。

圖6 抗原抗體Scatchard的結(jié)合曲線

2.4 親和力分析（SPR法）

采用成熟的SPR親和力測試方法在Biacore T100儀器上對上述結(jié)果進(jìn)行驗證，檢測流程為：

（1）抗原偶聯(lián)至CM5芯片；

（2）優(yōu)化樣品濃度及再生條件；

（3）設(shè)置濃度梯度。

使用Biacore T100儀器自帶的模板方法，設(shè)置一下參數(shù)：濃度梯度/（μg/mL）分別為0，2.5，5，10，20，40，進(jìn)樣時間為60 s，解離時間為600 s；再生條件為：pH1.5的甘氨酸鹽酸，30 μL/min，30 s。對高效毛細(xì)管電泳測試的親和力結(jié)果進(jìn)行驗證。圖7為親和力測試數(shù)據(jù)的擬合曲線圖，通過儀器自帶的擬合方法可得到納米抗體的親和力常數(shù)為4.512×109M-1。

圖7 Biacore測親和力

3 結(jié)論

本實驗用Biacore對高效毛細(xì)管電泳測納米抗體進(jìn)行了親和力驗證，Biacore測得親和力常數(shù)為4.512×109M-1、毛細(xì)管電泳測得親和力常數(shù)為4.87×109M-1，相對誤差為7.93%，結(jié)果相近，說明利用毛細(xì)管電泳測定納米抗體親和力方法可行。采用毛細(xì)管電泳方法分析納米抗體抗原親和力具有兩點(diǎn)優(yōu)勢。

（1）時間周期較短，毛細(xì)管測定樣品周期大約為5～10 min左右，同樣的樣品，采用Biacore T100儀器測定親和力時間大約為2.5 h。

（2）樣品損耗少，節(jié)約成本。毛細(xì)管由于自身管道較窄（75 μm×65 cm），測定較短時間短，這使得毛細(xì)管在測定親和力時樣品用量較少，樣品損耗在20 μL/次左右；Biacore在測定時樣品損耗為300 μL/次左右，由于抗原抗體價格昂貴，較低的使用量會減少費(fèi)用，控制試驗成本。

綜上所述，毛細(xì)管電泳測定納米抗體親和力，在較短的時間和較少的成本下，與實驗室常用精準(zhǔn)的Biacore測定結(jié)果相近，為納米抗體測定親和力提供新的研究方法。