溫敏性聚（N-異丙基丙烯酰胺）-b-聚（L-谷氨酸）的合成與表征

吳瑕，劉大軍，王琪，李榮，王薇

（長春理工大學 化學與環(huán)境工程學院，長春 130022）

如今，癌癥已經成為威脅人類健康的嚴重疾病之一。傳統(tǒng)抗癌藥物因為是小分子，存在穩(wěn)定性差、代謝快、缺乏選擇性、藥物利用率低、毒副作用大等問題。將藥物與適當?shù)募{米載體相結合，可以使其更好的發(fā)揮作用［1］。納米載體指能有效負載和傳遞藥物及影像探針的納米粒子，具有較大的比表面積、表面可功能化的特點［2］。由于實體瘤具有“高滲透和強滯留效應”，納米載體相比于正常組織更容易聚集在腫瘤組織附近，實現(xiàn)對腫瘤的被動靶向［3］。高分子膠束是一種常見的納米藥物載體，由兩親性分子在一定條件下自組裝形成，具有親水的外殼和疏水的內核，廣泛應用于疏水性藥物傳送［4］。

然而，傳統(tǒng)的高分子膠束不具有腫瘤主動靶向功能，無法對外界環(huán)境變化做出響應。近年來，具有pH敏感性、溫度敏感性、還原響應性等環(huán)境刺激響應的膠束作為藥物載體已被報道［5-7］。聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）是目前研究最廣泛的溫敏性聚合物之一，它的水溶液在32℃左右發(fā)生迅速的可逆相轉變［8］。由于和人體生理溫度接近，因此被廣泛地用于生物醫(yī)用材料領域。N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）聚合濃度的改變、聚合過程中引入其它聚合物等行為都可能對溫敏材料的溫敏行為產生影響［9-11］。

選用具有溫度敏感的NIPAM單體、通過ATRP法得到聚合物PNIPAM。脫去PNIPAM的叔丁氧羰基保護基得到大分子引發(fā)劑，引發(fā)γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-內羧酸酐單體（BLG-NCA）進行開環(huán)聚合，成功得到聚合度不同的嵌段聚合物PNIPAM100-b-PLGA20、PNIPAM60-b-PLGA20。以阿霉素（DOX）為藥物模型，制備載藥膠束，并在37℃、pH=7.4的磷酸緩沖溶液（PBS）中研究藥物的釋放行為。結果表明，聚合物膠束具有較高的載藥量，約為40%，同時具有較高的包封率，約為60%，DOX的最終釋放量高達70%～80%。因此，聚合物載藥膠束能高效負載阿霉素，可應用為藥物載體。

1 實驗

1.1 藥品精制及測試條件

所用藥品中，四氫呋喃（THF）使用前經Na回流，并蒸餾。N，N-二甲基甲酰胺（DMF）使用前經氫化鈣（CaH2）回流，并減壓蒸餾。γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-內羧酸酐（BLG-NCA）使用前重結晶三次。

傅里葉變換紅外光譜（IR）由FTIR-8400s光譜儀測得，用KBr壓片法，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。核磁共振氫譜（1HNMR）由Bruker AV 500M核磁共振儀測得，以四甲基硅烷（TMS）為內標。凝膠滲透色譜（GPC）采用Waters 5414凝膠色譜儀進行檢測，以DMF為流動相。動態(tài)光散射（DLS）測試使用WyattQELS儀器，光源為垂直偏正He-Ne激光，有效測試范圍為10～1 000 nm，樣品濃度為0.05 mg/mL。透射電子顯微鏡（TEM）通過JEOL JEM-1011透射電鏡進行測試，測試電壓為100 kV，制備0.1 mg/mL的聚合物水溶液，滴到銅網上，干燥制得透射電鏡樣品。臨界膠束濃度（CMC）用熒光光譜法測定，用Perkin-Elmer FLS-920 Edinburgh熒光光譜儀檢測波長393 nm處的激發(fā)光譜。DOX累積釋放曲線通過Shimadzu UV-2401PC UV-Vis型紫外分光光度計測量。

1.2 新型多功能引發(fā)劑的合成

將碳酸氫鈉（8.4 g，0.1 mol）與乙醇胺（6.0 g，0.1 mol）溶于THF和水的混合溶液（體積比為1∶2），后將二碳酸二叔丁酯溶解于50 mL THF溶液并使用恒壓滴液漏斗使其滴入碳酸氫鈉與乙醇胺的混合溶液中。反應在冰浴條件下進行30 min，后室溫下反應過夜。過濾，濾液用過量的乙醚萃取后用無水NaSO4干燥，密封過夜。旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到產物（2-羥基乙基）氨基甲酸叔丁酯（BEA）。

取BEA置于反應瓶中，加入80 mL甲苯130℃回流2 h共沸除水。向反應瓶中加入40 mL THF溶液稀釋，加入三乙胺7.6 mL（0.1 mol）。將22.9 g（0.1 mol）溴異丁酰溴溶于10 mL THF溶液，使用恒壓滴液漏斗將其滴入反應瓶中。冰浴反應30 min后移到室溫下，反應過夜，用G4漏斗過濾，余液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮。濃縮后用乙醚稀釋，并用去離子水洗兩次、5%的NaHCO3洗一次、5%鹽酸溶液洗兩次、3.5%的NaCl溶液洗一次，上層有機相用無水Na2SO4干燥過夜，真空抽干。抽干后得到的物質過硅膠柱，得到最終產物2-溴-2-甲基丙酸-2-叔丁氧羰基氨基乙酯（BEA-Br）。

1.3 PNIPAM的合成

以BEA-Br為引發(fā)劑，單體NIPAM，三（2-二甲氨基乙基）胺為絡合劑（Me6），CuCl為催化劑進行ATRP反應。將BEA-Br（0.031 g，0.1 mmol）、NIPAM（1.132 g，10 mmol）、Me6（53.4 μL）加入到反應瓶中，最后加入4 mL干燥的異丙醇作為反應的溶劑。用液氮使反應液冷凍后抽真空半小時，后通氮氣用水解凍，如此重復三次，以便除凈反應體系內的氧氣。在第三次反應液凍成固體時迅速加入CuCl（0.020 g，0.2 mmol），抽真空40 min，通入氮氣用水解凍。待反應液恢復到室溫后，將反應瓶置于70℃的油浴中反應6 h后迅速冷卻使反應停止。反應液用中性氧化鋁層析，以THF為淋洗液，除去銅離子。濃縮后用冷乙醚沉降三次，室溫下真空干燥24 h，得到白色固體粉末為最終產物PNIPAM100。用同樣的方法制備聚合物PNIPAM60。

1.4 帶端位氨基的大分子引發(fā)劑（PNIPAM-NH2）的合成

稱取0.6 g PNIPAM100溶解于4 mL三氟乙酸（TFA）和二氯甲烷的混合溶液中（體積比為1∶1），室溫下反應1 h后用冷乙醚沉降兩次，室溫下真空干燥24 h，產物為白色固體粉末PNIPAM100-NH2。以同樣方法制備聚合物PNIPAM60-NH2。

1.5 聚（N-異丙基丙烯酰胺）-b-聚（L-谷氨酸）（PNIPAM-b-PLGA）的合成

以PNIPAM100-NH2為引發(fā)劑，引發(fā)BLG-NCA進行開環(huán)聚合，得到聚（N-異丙基丙烯酰胺）-b-聚（L-谷氨酸酯）（PNIPAM-b-PBLG），脫去PNIPAM-b-PBLG的苯甲基保護基得到產物PNIPAM-b-PLGA。以聚合物PNIPAM100-b-PLGA20為例。首先稱取PNIPAM100-NH2（0.5 g）和20 mL無水甲苯進行共沸除水，棄去甲苯并接冷阱抽干殘留的少量甲苯。向反應瓶中加入BLG-NCA（0.4 g）溶解于10 mL DMF中，氮氣保護，在室溫下反應三天。反應結束后用冷乙醚沉降三次，固體產物在室溫下真空干燥24 h，得到白色固體產物PNIPAM100-b-PBLG20。以同樣方法制備PNIPAM60-b-PBLG20。

室溫下將產物 PNIPAM100-b-PBLG20（0.5 g）溶解在5 ml二氯乙酸（DCA）溶液中，加入1.5 mL氫溴酸/乙酸（HBr/CH3COOH 33 wt%）溶液，反應液在30℃下緩慢攪拌1 h。反應液用過量的丙酮沉降，并用丙酮洗滌多次，沉降物在室溫下真空干燥24 h，得到產物PNIPAM100-b-PLGA20。以同樣的方法制備聚合物PNIPAM60-b-PLGA20。PNIPAM-b-PLGA的具體合成方案如圖1所示。

圖1 PNIPAM-b-PLGA的合成方案

1.6 阿霉素（DOX）的負載和釋放實驗

取一定量的聚合物材料（20 mg）以及DOX（20 mg），均勻分散于pH=7.4的水溶液中，恒溫45℃水浴2 h后立即進行超速離心，真空抽干，得到載藥膠束。載藥膠束的體外釋放行為是在37℃、pH=7.4的磷酸緩沖溶液（PBS）中進行的。取載藥膠束溶解于2 mL PBS溶液中后，裝透析袋（3500Da）密封，放入20 mL PBS溶液中，恒溫37℃下進行釋放實驗。每隔一段時間取2 mL釋放介質，并補加2 mL PBS溶液。DOX的釋放通過紫外分光光度法（λ=480 nm）進行檢測［12］。

2 結果與討論

2.1 聚合物的核磁共振氫譜分析

圖2為PNIPAM與EA-PNIPAM的核磁共振氫譜圖，試劑為氘代氯仿。如圖2中（a）所示，1.00 ppm（g+c）處的共振峰歸屬于甲基（-CH3），1.15 ppm（h）處的共振峰歸屬于端位叔丁氧羰基上的甲基（（CH3）3-C-O-）。3.12 ppm（a）與3.98 ppm（b）處的共振峰歸屬于主鏈上的亞甲基（CH2-CH2-O-，CH2-CH2-O-）。1.44 ppm（d）與1.79 ppm（e）處的共振峰分別歸屬于重復單元上的亞甲基（-CH2-CH-）以及次甲基（-CH2-CH-）。3.65 ppm（f）處的共振峰歸屬于NIPAM重復單元異丙基上的次甲基（-（CH3）2-CH-），證明PNIPAM成功合成。圖2（b）中叔丁氧羰基上甲基的共振峰（h）消失，說明叔丁氧羰基成功脫去，得到大分子引發(fā)劑EA-PNIPAM。PNIPAM的聚合度由d處與a處的信號峰面積比算得，經計算PNIPAM的聚合度分別為89、46。

圖2 PNIPAM（a），EA-PNIPAM（b）的核磁共振氫譜圖

圖3為聚合物PNIPAM-b-PBLG、PNIPAM-b-PLGA的核磁共振氫譜圖，試劑為氘代三氟乙酸。如圖3中（a）所示，3.13 ppm（a）與4.12 ppm（b）處的共振峰均歸屬于主鏈上的亞甲基（CH2-CH2-O-，CH2-CH2-O-）。1.00 ppm（g+c）處的共振峰歸屬于甲基（-CH3）。2.25 ppm（d）處的共振峰歸屬于PNIPAM重復單元上的亞甲基（-CH2-CH-）。3.65 ppm（f）處的共振峰歸屬于側鏈異丙基上的次甲基（-（CH3）2-CH-），1.75 ppm處PBLG結構單元的亞甲基峰（i）（-CH2-CH2C（O）-）與PNIPAM結構單元次甲基峰（e）（-CH2-CH-）重合。4.42 ppm（h）處的共振峰是PBLG中質子的特征峰。2.20 ppm和1.88 ppm（j）處出現(xiàn)的是PBLG側基的亞甲基的振動峰（-CH2-CH2C（O）-）。4.75 ppm（k）、6.92 ppm（l）處為PBLG結構單元上的亞甲基（-（O）CH2-）以及苯環(huán)上的次甲基的振動峰（-C6H5），證明PBLG成功合成。通過峰h與峰b的積分面積可算出PBLG結構單元的聚合度，經計算兩組聚合物中PBLG的聚合度分別為16、12。圖3（b）中k、l處的共振消失證明了苯甲基保護基的成功脫除，聚合物PNIPAM-b-PLGA成功制備。

圖3 PNIPAM-b-PBLG（a），PNIPAM-b-PLGA（b）的核磁共振氫譜圖

2.2 聚合物的紅外光譜分析

圖4 不同聚合物的紅外光譜圖

如圖4（a）PNIPAM的紅外光譜圖中所示，1 660 cm-1處碳碳雙鍵的伸縮振動峰消失，3 170 cm-1處烯烴的C-H鍵的伸縮振動峰消失，1 040 cm-1處出現(xiàn)酯鍵的特征峰，說明NIPAM單體成功聚合。圖（4b）PNIPA-b-PLGA的紅外光譜圖中，3 060 cm-1處苯環(huán)上C-H伸縮振動吸收峰消失，1 432 cm-1處出現(xiàn)的峰為羧基上-OH的特征峰，證明苯甲基脫保護成功，得到最終產物PNIPAM-b-PLGA。

2.3 聚合物的凝膠滲透色譜（GPC）分析

用凝膠色譜儀對制備的不同聚合物的分子量及分子量分布進行測試。結果如表1所示，PNIPAM60、PNIPAM100的分子量成比例增加，脫去丁氧羰基保護基后的聚合物EA-PNIPAM60、EA-PNIPAM100分子量降低。引發(fā)BLG-NCA開環(huán)聚合后PNIPAM60-b-PBLG20、PNIPAM100-b-PBLG20的分子量均出現(xiàn)相應的增長。脫掉聚合物重復單元的苯甲基保護基，分子量降低。測試結果從分子量的角度 證 明 了 PNIPAM60-b-PLGA20、PNIPAM100-b-PLGA20的成功合成。

表1 不同聚合物的分子量及分子量分布指數(shù)

2.4 低臨界溶解溫度（LCST）的測定

PNIPAM聚合物的LCST為32～34℃，聚合物溶液由透明迅速轉變至渾濁。此外，聚合物濃度的改變、其他聚合物的引入均會導致其LCST發(fā)生變化。使用紫外分光光度法測定λ=500 nm處聚合物溶液透過率的變化確定其LCST值［13］。如圖5所示，PNIPAM100-b-PLGA20與PNIPAM60-b-PLGA20在pH=7.4的水溶液中的低臨界溶解溫度分別為36℃、37℃。堿性條件下聚L-谷氨酸的側鏈羧基轉化為羧酸鹽，在水溶液中的溶解性很好，并且隨著溫度的升高其溶解度增大，由于親水鏈段PLGA的引入，導致聚合物的LCST升高。

圖5 λ=500 nm下聚合物溶液的透過率隨溫度變化曲線

2.5 聚合物膠束

以疏水性的芘為熒光探針測試聚合物的臨界膠束濃度（CMC）并討論聚合物的組成對膠束性能的影響［14］。聚合物CMC測試表明，PNIPAM100-b-PLGA20與PNIPAM60-b-PLGA20在溫度低于LCST、pH=7.4的水溶液中芘的熒光強度沒有出現(xiàn)紅移即不成膠束。但當溫度高于LCST時，如圖6所示，芘的熒光強度會出現(xiàn)從334.69 nm到336.28 nm的紅移，形成以疏水性的PNIPAM為核，親水性的PLGA為殼的膠束。以聚合物熒光強度之比（I336.28/I334.69）為縱坐標，樣品濃度值的對數(shù)（lg c）為橫坐標作圖，圖中水平線與切線的交點為CMC值（圖7）。PNIPAM100-b-PLGA20與PNIPAM60-b-PLGA20的CMC值主要受到鏈段PNIPAM的影響。當溫度升高時，PNIPAM發(fā)生由親水到疏水的轉變，疏水鏈段比例的增加，聚合物的CMC降低。因此PNIPAM100-b-PLGA20的CMC值（3.715×10-3g/L-1）低于PNIPAM60-b-PLGA20的CMC值（13.81×10-3g/L-1）。

圖6 溫度高于LCST時，相同濃度的芘在不同濃度的PNIPAM100-b-PLGA20溶液中的激發(fā)光譜（λ=393 nm）

圖7 聚合物激發(fā)光譜強度之比（I336.28/I334.69）對lg c的曲線

圖8是聚合物膠束在pH=7.4、45℃的水溶液中的流體力學半徑（Rh）以及透射電鏡圖（TEM）。PNIPAM60-b-PLGA20膠束的Rh值為（96.7±7.6）nm（圖8（a）），PNIPAM100-b-PLGA20膠束的Rh值為（78.4±2.1）nm（圖8（c））。TEM結果表明兩組聚合物納米膠束均呈球形，形狀較為規(guī)則，PNIPAM60-b-PLGA20膠束的粒徑為58 nm（圖8（b））、PNIPAM100-b-PLGA20膠束的粒徑為44 nm（圖8（d））。由TEM所測得的粒徑低于由DLS所測得的粒徑，這主要是由于在TEM測試中，高能電壓的強烈作用使膠束粒子明顯收縮［15］。PNIPAM100-b-PLGA20膠束的Rh值低于PNIPAM60-b-PLGA20膠束的Rh值，這是由于溫度高于LCST時，PNIPAM發(fā)生由親水向疏水性轉變，疏水段的比例高導致疏水段相互作用增強。綜上，聚合物的組成對Rh值有影響。

圖8 聚合物膠束在pH=7.4的水溶液中的流體力學半徑（Rh）及透射電鏡圖

2.6 DOX的體外釋放研究

DOX廣泛應用于治療不同類型的癌癥。聚合物膠束PNIPAM100-b-PLGA20與PNIPAM60-b-PLGA20作為納米級載體，可實現(xiàn)DOX的負載。聚合物膠束的載藥量（DLC）、包封率（DLE）如表2所示。聚合物PNIPAM100-b-PLGA20膠束的DLC、DLE高于聚合物膠束PNIPAM60-b-PLGA20。這是由于疏水嵌段比例的增加使膠束的核收縮的同時提高了阿霉素的負載量。圖9是兩組聚合物載藥膠束在37℃、pH=7.4的PBS緩沖溶液中的累積釋放曲線。如圖9所示，載藥膠束的緩慢釋放長達72 h，PNIPAM60-b-PLGA20與PNIPAM100-b-PLGA20載藥膠束最終釋放量分別為原始載藥量的78.2%、69.8%。此外，由于PNIPAM100-b-PLGA20載藥膠束在高于其LCST時，疏水部分比例高，其膠束內核的疏水能力強，導致DOX的釋放速率低于PNIPAM60-b-PLGA20載藥膠束。兩種聚合物膠束均可實現(xiàn)DOX緩慢釋放，有一定的潛在應用價值。

表2 聚合物膠束的載藥性能

圖9 37℃聚合物載藥膠束在pH=7.4的PBS緩沖溶液中的累計釋放曲線

3 結論

以二碳酸二叔丁酯、乙醇胺、溴異丁酰溴等為原料制備新型多功能引發(fā)劑，采用ATRP法與NCA開環(huán)聚合法成功制備聚合物PNIPAM100-b-PLGA20與PNIPAM60-b-PLGA20。兩組聚合物的LCST與人體體溫相接近，并且在溫度高于其LCST時可以自組裝成粒徑在100 nm以下的球狀膠束。兩組聚合物膠束均成功負載阿霉素，載藥量約為40%，包封率約為60%，緩慢釋放長達72 h，是潛在的納米藥物載體。