兔子血液、滑膜、軟骨及軟骨下骨鎘含量檢測(cè)及相關(guān)性分析

馬向輝 李明 郭磊

[摘要]目的 研究兔慢性飲水型鎘中毒血液、滑膜、軟骨及軟骨下骨鎘含量及其相關(guān)性。方法 28只新西蘭大白兔，均為兩個(gè)半月齡，雌雄各半，從雌性及雄性大白兔中各隨機(jī)取1只，逐次抓取，將其分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組14只，單籠喂養(yǎng)。對(duì)照組用正常飲用水喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組用40 mg/L氯化鎘飲用水喂養(yǎng)。3個(gè)月后處死，采用原子吸收光譜法測(cè)定標(biāo)本中鎘的含量。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組兔子血液，滑膜、軟骨及軟骨下骨鎘含量較對(duì)照組表達(dá)明顯增高（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨鎘含量與軟骨下骨、滑膜及血液中的鎘含量成正相關(guān)（r=0.959，0.556，0.942;P<0.05）。結(jié)論 兔慢性飲水型鎘中毒可導(dǎo)致鎘在血液、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中蓄積，關(guān)節(jié)軟骨中的鎘來(lái)源于軟骨下骨、滑膜及血液，但主要來(lái)源于軟骨下骨，鎘在上述組織中蓄積，最終可能會(huì)導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]鎘;中毒;軟骨;骨關(guān)節(jié)炎;兔;膝

[中圖分類號(hào)] R114? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）9（c）-0038-03

[Abstract] Objective To study the content and correlation of cadmium in blood， synovium， cartilage and subchondral bone of rabbits after drinking water with cadmium gradually. Methods Twenty-eight New Zealand white rabbits （equal proportion of male to female） aged two and a half months old， were randomly selected from female and male groups alternatively. They were divided into control group and experimental group， 14 rabbits in each group. They were fed in every single cage. In the control group， rabbits were fed with normal drinking water， and in the experimental group， they were fed with water containing 40 mg/L cadmium chloride. After three months， all rabbits were sacrificed. The cadmium content in the specimens was determined by atomic absorption spectrometry. Results The cadmium content in the blood， synovium， cartilage and subchondral bone of the experimental group was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. The cadmium content of the articular cartilage in the experimental group was positively correlated with the cadmium content in the subchondral bone， synovium and blood（r=0.959， 0.556， 0.942; P<0.05）， respectively. Conclusion Chronic poisoning of drinking water containing cadmium can cause cadmium accumulation in blood， synovium， articular cartilage and subchondral bone. Cadmium in articular cartilage is derived from subchondral bone， synovium， and blood， but mainly from subchondral bone. Cadmium accumulates in these tissues and may eventually lead to osteoarthritis.

[Key words] Cadmium; Poisoning; Cartilage; Osteoarthritis; Rabbit; Knee

鎘是一種有毒的重金屬，具有很強(qiáng)的生物活性，鎘在土壤及水中具有較強(qiáng)的化學(xué)活性，進(jìn)入食物鏈后，若被人及動(dòng)物攝入，會(huì)在體內(nèi)蓄積，影響多種臟器功能。研究較多的是鎘易在骨及腎臟大量蓄積導(dǎo)致骨質(zhì)疏松及腎臟的損傷[1]，但鎘是否易在關(guān)節(jié)軟骨及滑膜等處蓄積，是否影響其功能，以及如何影響，目前研究較少，本研究通過(guò)飲水的方式使兔子染毒，然后測(cè)定兔子血液、滑膜、軟骨及軟骨下骨的鎘含量，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭大白兔28只，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均為2個(gè)半月齡，平均體重（1.38±0.18）kg，雌雄各半。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

將28只新西蘭大白兔隨機(jī)分成兩組，雌雄各半，每組14只。置于鐵籠內(nèi)，自由攝食及飲水，采用飲水染毒的方法，實(shí)驗(yàn)組用40 mg/L氯化鎘飲用水喂養(yǎng)，對(duì)照組用正常飲用水喂養(yǎng)，其他條件相同。在染毒期間，每日觀察并記錄每組大白兔的飲水量，飼養(yǎng)3個(gè)月后用空氣栓塞法處死，開(kāi)胸后用10 ml注射器從左心室取全血5 ml，放入含抗凝劑的玻璃瓶中-70℃保存。完整剖取雙膝關(guān)節(jié)（包括股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端）全層軟骨，剝?nèi)‰p膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜，取脛骨平臺(tái)處部分軟骨下骨，分別放入玻璃瓶中-70℃保存。用15 ml消解液（HNO3與HLO4按4∶1混合）與準(zhǔn)確稱量質(zhì)量的標(biāo)本相混合，完全消化后，用容量瓶定容至50 ml，然后取定容液2 ml，采用原子吸收光譜法測(cè)定標(biāo)本中鎘的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)及直線相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組不同組織鎘含量的比較

實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、血液及軟骨下骨鎘含量均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨鎘含量與滑膜、血液及軟骨下骨鎘含量相關(guān)性分析

關(guān)節(jié)軟骨鎘含量與滑膜鎘含量成正相關(guān)（r=0.556，P=0.039）;與血液鎘含量成正相關(guān)（r=0.942，P=0.000）;與軟骨下骨鎘含量成正相關(guān)（r=0.959，P=0.000）。其中軟骨下骨鎘含量相關(guān)度最高，血液及滑膜次之。

3討論

血鎘水平可反映兔子體內(nèi)鎘蓄積的程度及近期鎘暴露的情況，實(shí)驗(yàn)組兔血液中鎘含量較對(duì)照組明顯升高，與其飲用富含鎘的水密切相關(guān)。鎘經(jīng)消化道吸收后進(jìn)入兔體內(nèi)，部分存在于紅細(xì)胞中與血紅蛋白結(jié)合，部分存在于血清中，實(shí)驗(yàn)組兔滑膜及軟骨鎘含量均高于對(duì)照組，提示其均為鎘蓄積的器官，兔滑膜組織中有血液循環(huán)，分析鎘是通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入滑膜的，由于正常關(guān)節(jié)軟骨中沒(méi)有血液循環(huán)，關(guān)節(jié)軟骨中的鎘應(yīng)該來(lái)源于與其相鄰的有血液循環(huán)的軟骨下骨和滑膜，軟骨下骨中的血液中所含的鎘被軟骨細(xì)胞吸收，滑膜中的鎘分泌入關(guān)節(jié)液后，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞將其吸收可能是關(guān)節(jié)軟骨中鎘的來(lái)源。

關(guān)節(jié)滑膜由基質(zhì)和細(xì)胞及纖維構(gòu)成。內(nèi)表層平滑，為1～3層結(jié)締組織細(xì)胞，又稱滑膜細(xì)胞，電鏡下可見(jiàn)彼此分開(kāi)而以細(xì)棘相連。因功能狀態(tài)不同可分A及B兩種類型。A型滑膜細(xì)胞主要清除關(guān)節(jié)腔和細(xì)胞外基質(zhì)的降解物，B型滑膜細(xì)胞合成和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)和滑液的成分。細(xì)胞層下方即為毛細(xì)血管網(wǎng)，其下為纖維組織，其厚度因部位而不一，含有血管、淋巴管和神經(jīng)纖維，細(xì)胞成分有纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。

關(guān)節(jié)滑膜可參與關(guān)節(jié)軟骨的破壞過(guò)程[2-3]，滑膜發(fā)炎時(shí)，可以產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如白介素-1（IL-1），腫瘤壞死因子（TNF-α）。IL-1可促進(jìn)滑膜細(xì)胞合成并釋放前列腺素E2（PGE2）、NO和膠原酶，產(chǎn)生較強(qiáng)的促炎作用，加重滑膜的炎癥，能刺激滑膜成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)滑膜細(xì)胞與黏附分子（ICAM-1）的表達(dá)，造成關(guān)節(jié)軟骨破壞，而關(guān)節(jié)軟骨破壞產(chǎn)生的顆粒及基質(zhì)的破壞產(chǎn)物均能誘發(fā)和加重滑膜炎，促進(jìn)IL-1進(jìn)一步釋放。TNF-α可刺激滑膜細(xì)胞PGE的產(chǎn)生，增加骨軟骨的破壞。IL-1和TNF-α均可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生降解軟骨基質(zhì)的酶MMP-1、3、13等，從而使關(guān)節(jié)軟骨破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)生[4-5]。骨性關(guān)節(jié)炎又稱退行性關(guān)節(jié)病，骨質(zhì)增生，骨關(guān)節(jié)病。以軟骨變性為特征性病理改變。李保馳等[6]研究發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜中的MMP-3及MMP-13表達(dá)明顯上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)鎘在滑膜中蓄積，是否導(dǎo)致滑膜炎發(fā)生，尚需對(duì)滑膜進(jìn)行組織學(xué)染色觀察及對(duì)相關(guān)因子及酶進(jìn)行檢測(cè)以明確。

關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞，軟骨基質(zhì)及水組成。軟骨細(xì)胞具有合成分泌并維持細(xì)胞外基質(zhì)的功能。細(xì)胞外基質(zhì)由膠原蛋白、蛋白纖維、組織液、非膠原蛋白組成，膠原纖維構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的基本框架，維持關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗張力強(qiáng)度的功能。組織液和基質(zhì)大分子間的相互作用為組織提供硬度和抗機(jī)械壓力，蛋白多糖帶有大量負(fù)電荷，可吸附水分子，使軟骨具有彈性，抗壓性。

軟骨下骨指關(guān)節(jié)軟骨沉積線以下的軟骨下骨板和骨小梁結(jié)構(gòu)，軟骨下骨板位于鈣化軟骨層與骨小梁之間，為皮質(zhì)化板層結(jié)構(gòu)，類似于皮質(zhì)骨。起傳導(dǎo)分散應(yīng)力，抵抗剪切力，緊密聯(lián)系骨軟骨的作用。

軟骨與軟骨下骨在解剖位置上緊密相鄰，生理功能方面密切聯(lián)系，病理方面相互影響，是一個(gè)相互作用、相互依賴、既獨(dú)立又統(tǒng)一的功能單位。Radin等[7]認(rèn)為，軟骨下骨像一把堅(jiān)硬的椅子，而關(guān)節(jié)軟骨就像放在上面的軟墊，軟骨下骨能吸收應(yīng)力，緩沖震蕩，維持關(guān)節(jié)的正常形狀。在負(fù)重狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生形變，猶如鐵軌與枕木之間的橡皮墊，可以保護(hù)軟骨下骨不受破壞，或者僅發(fā)生輕微的損傷。當(dāng)解除壓力，由于彈性作用可迅速恢復(fù)原狀，這種彈性作用越強(qiáng)，緩沖效果越佳。有研究表明鎘可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[1，8-9]，發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，軟骨下骨脫鈣明顯，骨量減少，骨小梁數(shù)量下降，間距增加，吸收應(yīng)力能力下降，容易出現(xiàn)微骨折，導(dǎo)致軟骨下骨塌陷，正常關(guān)節(jié)形狀發(fā)生改變，從而出現(xiàn)關(guān)節(jié)面受力不均，受力較集中的區(qū)域軟骨容易發(fā)生退行性變。Bobinac等[10]認(rèn)為，在骨性關(guān)節(jié)炎中是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變導(dǎo)致軟骨下骨的生物力學(xué)及生化學(xué)方面改變，應(yīng)用組織學(xué)及組織化學(xué)方法對(duì)人工膝關(guān)節(jié)置換患者及正常尸體膝關(guān)節(jié)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示軟骨下骨形態(tài)學(xué)改變發(fā)生于關(guān)節(jié)軟骨退變后，且與關(guān)節(jié)軟骨退變程度成正相關(guān)。

本研究結(jié)果提示，鎘可在兔關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中異常蓄集，可能會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生，關(guān)節(jié)軟骨亦可能出現(xiàn)損傷退變，最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生，但骨質(zhì)疏松與關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生的先后及相互影響的機(jī)制需進(jìn)一步研究。

有研究顯示[11-12]，鎘能引起細(xì)胞凋亡。Corcoran等[13]研究結(jié)果現(xiàn)示，DNA損傷是引發(fā)細(xì)胞凋亡的開(kāi)始。關(guān)于鎘如何引起DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，目前有鈣通道學(xué)說(shuō)及鎘影響如c-jun，c-fos，c-myc等癌基因，抑癌基因p53等學(xué)說(shuō)[14]。而最近有研究顯示鎘可通過(guò)鈣通道誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡[15]。

軟骨細(xì)胞凋亡在骨性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。Gibson等[16]在終末分化的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中存在凋亡現(xiàn)象，裴明等[17]研究結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)軟骨退變時(shí)，患者不僅軟骨細(xì)胞表達(dá)A型膠原，而且存在軟骨細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨退變，軟骨細(xì)胞減少，軟骨細(xì)胞過(guò)度調(diào)亡可能是軟骨細(xì)胞數(shù)量減少的重要原因，是發(fā)病的重要病理機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)是否導(dǎo)致慢性飲水型鎘中毒的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡目前尚不明確。

本研究結(jié)果提示，慢性飲水型鎘中毒可導(dǎo)致鎘在血液、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中異常蓄積，推測(cè)持續(xù)蓄積可能導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。進(jìn)一步研究滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨形態(tài)學(xué)方面的變化及骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的因子如IL-1、TNF-α以及金屬蛋白酶MMP-3、13等在相關(guān)組織中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制能進(jìn)一步加深對(duì)鎘在上述組織中蓄積相互間影響的認(rèn)識(shí)。鎘可導(dǎo)致多種細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，但能否導(dǎo)致兔膝關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)凋亡及作用機(jī)制尚不明了，仍需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-05-29? 本文編輯：崔建中）