眼絡(luò)通對(duì)兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響*

馮燕兵 熊 烈 曾子善 沈志新 朱潔云 徐 蘊(yùn) 石彥波 翁文慶#

1浙江省嘉興市中醫(yī)醫(yī)院 浙江 嘉興314000 2浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州310051 3江蘇省啟東市人民醫(yī)院 江蘇 啟東226200

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（RVO）是一種常見的危害視功能的視網(wǎng)膜血管疾病。本研究旨在探討眼絡(luò)通方對(duì)RVO新西蘭兔視網(wǎng)膜組織血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）mRNA表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)健康實(shí)驗(yàn)新西蘭兔66只，體重1.5～2.0kg，雄性，眼檢查無異常，購(gòu)自嘉興學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2013-0056。將動(dòng)物隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組6只，模型對(duì)照組、天保寧組、眼絡(luò)通低、中、高劑量組各12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及儀器：眼絡(luò)通顆粒方（葛根20g，川芎、地龍、三棱各10g，水蛭3g），由嘉興市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供；天保寧（博普-益普生工業(yè)公司，批號(hào)：H2003122）；20%烏拉坦（嘉興學(xué)院提供）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，18080-051）；SYBR Green 熒光定量試劑盒（Thermo Fisher，A25742）；ABI 7500熒光定量PCR儀。

1.3 RVO 家兔模型的建立：健康新西蘭兔充分?jǐn)U瞳，20%烏拉坦全身麻醉，拍攝無赤光眼底像，氬離子激光封閉兔視乳頭兩側(cè)髓翼血管系之主干靜脈（光凝斑直徑200～250μm，功率600～800mW，時(shí)間0.3～0.5s）。造模完成24h后作眼底血管造影檢查，驗(yàn)證是否成功。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥方法：術(shù)后24h 開始灌胃給藥，1次/天，連續(xù)給藥4周，參照體重劑量換算方法計(jì)算給藥量；空白對(duì)照組及模型對(duì)照組給予5ml/kg生理鹽水；天保寧組給藥劑量0.02g/kg；眼絡(luò)通低、中、高劑量組分別給藥劑量2.3g/kg、4.6g/kg、6.9g/kg。

1.5 取材及樣本保存：造模后連續(xù)灌胃給藥干預(yù)，分別在干預(yù)后的第1、2、4周，空氣處死，每次空白組2只，余組每組4只。及時(shí)摘除眼球，制成眼杯，分離取出視網(wǎng)膜組織，于液氮中快速冷凍后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)VEGF、PDGF、PEDF mRNA 的表達(dá)：將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為模板β-actin為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，特異性引物序列見表1，熒光定量PCR 反應(yīng)條件見表2。采用△△Ct 法計(jì)算各基因mRNA 的表達(dá)情況，倍增變化率=2-△△Ct（△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-空白對(duì)照組△Ct，△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）。

表1 特異性引物序列

表2 熒光定量PCR反應(yīng)條件

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較使用方差分析，兩兩比較使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

VEGF 與PDGF 基因mRNA 表達(dá)量各組趨勢(shì)相似，見圖1。模型對(duì)照組在造模1、2、4周后，VEGF 與PDGF 基因mRNA表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組同期（均P＜0.05），且在第2周時(shí)表達(dá)量最高；VEGF 分別上調(diào)約860%、1530%、980%，PDGF 分別上調(diào)約830%、2690%、1040%。天保寧組較模型對(duì)照組除第4周VEGF 基因mRNA 表達(dá)量下調(diào)約20%外（P＜0.05），其余各點(diǎn)兩者表達(dá)量無顯著差異（均P＞0.05）。眼絡(luò)通各劑量組同一時(shí)間點(diǎn)隨給藥濃度的上升VEGF 與PDGF 基因mRNA 表達(dá)量逐漸下降，且眼絡(luò)通高劑量組的第2周高峰均消失。眼絡(luò)通高劑量組第1、2、4周VEGF 基因mRNA 表達(dá)量較模型對(duì)照組分別下調(diào)約60%、80%、70%（均P＜0.05）；PDGF 分別下調(diào)約60%、80%、60%（均P＜0.05），但二者各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量仍均顯著高于空白對(duì)照組（均P＜0.05）。

圖1 眼絡(luò)通方對(duì)RVO家兔視網(wǎng)膜VEGF（左）和PDGF（右）表達(dá)的影響

PEDF 基因mRNA 表達(dá)量呈相反趨勢(shì)，見圖2。模型對(duì)照組在造模1、2、4周后，PEDFmRNA 表達(dá)量分別下調(diào)約40%、30%、50%（均P＜0.05）。天保寧組較模型對(duì)照組分別上調(diào)約160%、180%、250%（均P＜0.05）。眼絡(luò)通各劑量組同一時(shí)間點(diǎn)隨給藥濃度上升，PEDFmRNA 表達(dá)量逐漸上升，且眼絡(luò)通高劑量組在第2周時(shí)出現(xiàn)高峰。眼絡(luò)通高劑量組各時(shí)間點(diǎn)PEDFmRNA 表達(dá)量較模型對(duì)照組分別上調(diào)約430%、780%、540%（均P＜0.05），且較空白對(duì)照組分別上調(diào)約190%、280%、190%（均P＜0.05）。

圖2 眼絡(luò)通方對(duì)RVO家兔視網(wǎng)膜PEDF表達(dá)的影響

3 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（RVO）屬于中醫(yī)學(xué)中“暴盲”范疇，病因、病機(jī)復(fù)雜多樣，其客觀結(jié)果皆為瘀血形成，以活血化瘀法為基本治法，眼絡(luò)通由葛根、川芎、地龍、三棱、水蛭五味中藥組成，全方共奏活血化瘀、破血消積之效[1]。

目前認(rèn)為，VEGF、PDGF、PEDF在RVO新生血管形成中發(fā)揮重要作用。VEGF 是促進(jìn)血管新生最重要的誘導(dǎo)因子；同為血管生成因子的PDGF 不僅能單獨(dú)促進(jìn)新生血管生成，同時(shí)對(duì)VEGF 有促進(jìn)作用，能顯著上調(diào)VEGF 表達(dá)[2]。PEDF 對(duì)VEGF、PDGF 表達(dá)也起到拮抗作用，抑制新生血管生成[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF與PDGF基因mRNA相對(duì)表達(dá)量在模型對(duì)照組1周、2周、4周3個(gè)時(shí)相中表達(dá)皆高于空白對(duì)照組，這與既往研究中發(fā)現(xiàn)RVO 發(fā)生后，眼內(nèi)VEGF 有較高表達(dá)這一結(jié)果相符[4]；與PDGF 在脈絡(luò)膜新生血管模型中呈現(xiàn)高表達(dá)[2]及BRVO 患者的房水中表達(dá)顯著增高[5]這一研究結(jié)果相符。對(duì)于各用藥組而言，天保寧組對(duì)RVO 新西蘭兔視網(wǎng)膜VEGF 與PDGF 基因表達(dá)影響較小，基本與模型對(duì)照組無差異；而眼絡(luò)通各劑量組隨著給藥濃度的上升，VEGF 與PDGF 基因表達(dá)量逐漸降低，且以眼絡(luò)通高劑量組表達(dá)量最低。值得注意的是，模型對(duì)照組中VEGF、PDGF 基因在第2周時(shí)表達(dá)量最高，我們猜測(cè)這可能與造模前新西蘭兔健康狀況良好，視網(wǎng)膜及血管自我修復(fù)能力強(qiáng)，造模后視網(wǎng)膜側(cè)支循環(huán)形成速度快有關(guān)。有研究表明，在鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中PEDF 表達(dá)明顯下降[3]，本研究得到了相似的結(jié)果：模型對(duì)照組各時(shí)相PEDF 基因mRNA 表達(dá)低于空白對(duì)照組。眼絡(luò)通各劑量組PEDF 各時(shí)相表達(dá)量與VEGF、PDGF 呈負(fù)相關(guān)，且以眼絡(luò)通高劑量組上調(diào)最為明顯。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)在RVO 新西蘭兔視網(wǎng)膜組織中VEGF 與PDGF 基因的表達(dá)與眼絡(luò)通給藥劑量呈負(fù)相關(guān)，與PEDF 呈正相關(guān)。說明，上述3種因子可能是眼絡(luò)通治療RVO的作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為眼絡(luò)通方的臨床應(yīng)用提供了有力的支撐。