靶向抑制TANK結(jié)合激酶1表達對舌及下咽鱗癌細胞增殖及凋亡的影響△

王亞平 邱雁君 李玲香 崔曉波 張莉 胡文良 賀利平

TANK結(jié)合激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)是Ⅰ型干擾素合成過程中最為關(guān)鍵的蛋白激酶，主要是在由細菌引起的或者是由病毒引起的固有免疫途徑中發(fā)揮重要作用。人體的幾乎所有組織中，包括皮膚、腦、肝臟、脾臟、胃、小腸、心臟、胸腺、肺、腎臟等組織和器官，TANK結(jié)合激酶1都有較為穩(wěn)定且廣泛的表達[1]。有研究顯示TBK1與機體的細胞自噬以及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有顯著的相關(guān)性[2,3]。有關(guān)TBK1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究顯示，TBK1在腫瘤組織中的蛋白表達水平往往高于其在正常對照組織中的表達[4～6]；已有前期的研究顯示，TBK1在頭頸部鱗癌細胞的表達高于其在正常組織中的表達，在頭頸部腫瘤的早期診斷和治療上具有積極的意義。本課題組前期研究中，通過GEO大數(shù)據(jù)等系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)TBK1表達異?？赡芘c頭頸鱗癌狀細胞增殖及凋亡改變有相關(guān)性[7]；轉(zhuǎn)染靶基因siRNA是目前常用的基因靶向抑制的方法，本研究采用轉(zhuǎn)染TBK1-siRNA的方法對舌及下咽鱗癌細胞FaDu及Cal-27的TBK1基因進行靶向干預(yù)，以進行后續(xù)研究；此外，氨來呫諾(amlexanox)是一種特異性的TBK1 抑制劑[8]，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并具有抗炎作用[9]，本研究采用氨來呫諾梯度濃度處理后觀察其對FaDu及Cal-27細胞增殖的影響，進一步探討靶向抑制TBK1基因后對舌部、咽部腫瘤中鱗狀細胞增殖與凋亡水平影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 本研究所采用的人咽鱗癌細胞系FaDu以及人舌鱗癌細胞系Cal-27均由武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科研究所保種，采用DMEM高糖培養(yǎng)基，10%胎牛血清，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。TBK1-siRNA購買于廣州市銳博生物科技有限公司(Ribo Bio Co Ltd，Guangzhou, China，公司官方網(wǎng)址為http: //www.ribobio.com)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM 2000，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司(Beyotime Bio Co Ltd，Shanghai, China，公司官方網(wǎng)址為http: //www.beyotime.com)，TBK1抑制劑氨來呫諾購買于MCE(MedChemExpress Co Ltd，NJ，USA，公司官方網(wǎng)址為https://www.medchemexpress.cn)。

1.2方法

1.2.1蛋白質(zhì)印跡實驗 為了研究舌及下咽鱗癌細胞中TBK1的表達改變是否會對細胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，采用TBK1-siRNA轉(zhuǎn)染舌及下咽鱗癌細胞FaDu、Cal-27，對舌及下咽鱗癌細胞FaDu、Cal-27細胞的TBK1蛋白表達進行靶向抑制，轉(zhuǎn)染后采用蛋白質(zhì)印跡實驗檢測TBK1蛋白表達抑制的情況，實驗分組：FaDu、FaDu/siCTRL、FaDu/siTBK1、Cal-27、Cal-27/siCTRL、Cal-27/siTBK1。將處在對數(shù)生長期的細胞，提取各組細胞的總蛋白后進行蛋白印跡實驗，將蛋白樣品通過電泳和電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用封閉液封閉2 h后敷上一抗(GAPDH、TBK1)，4 ℃孵育過夜，用TBST清洗三遍后將膜敷二抗1 h，最后用Oddesy的增強化學(xué)熒光掃描膜上的蛋白，使用Oddesy軟件分析其譜帶強度。

1.2.2流式細胞術(shù)實驗 為了研究舌及下咽鱗癌細胞中TBK1的表達改變是否會對細胞凋亡產(chǎn)生影響，用TBK1-siRNA轉(zhuǎn)染舌及下咽鱗癌細胞FaDu、Cal-27后，采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡改變。實驗分組：FaDu、FaDu/siCTRL、FaDu/siTBK1、Cal-27、Cal-27/siCTRL、Cal-27/siTBK1。將處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，收集細胞，包括上清和貼壁的細胞，用PBS清洗兩次后固定細胞，然后分別加入5 μL的FITC和10 μL的PI染色，最后用流式細胞儀檢測細胞的凋亡，可被FITC/PI染色的為凋亡細胞。

1.2.3細胞增殖實驗 為了研究舌及下咽鱗癌細胞中TBK1的表達改變是否會對細胞增殖產(chǎn)生影響，采用CCK-8法檢測梯度濃度氨來呫諾處理的FaDu及Cal-27細胞增殖改變。將處在對數(shù)生長期細胞，采用梯度濃度(0、100、300、500 μM)氨來呫諾處理，分別以每孔1×103個細胞種植到96孔板中，將10 μL/孔的CCK-8加到96孔板中，37 ℃著色1h后，使用酶標儀在450 nm波長下測定光密度值(OD值)，并記錄數(shù)據(jù)。對細胞活性的影響用測定細胞活性的OD值比上對照組細胞的OD值的百分比來表示，并計算其IC50。

1.2.4克隆形成實驗 為了進一步驗證舌及下咽鱗癌細胞中TBK1的表達改變是否會對細胞增殖產(chǎn)生影響，用克隆形成實驗對梯度濃度氨來呫諾處理的舌及下咽鱗癌細胞FaDu、Cal-27的增殖改變進行檢測，從不同于靶向干擾TBK1表達的角度去驗證TBK1在舌及下咽鱗癌細胞增殖中的作用。取對數(shù)生長期細胞，采用梯度濃度(0、100、300、500 μM)氨來呫諾處理24 h后，消化并吹打成單個細胞，制備細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中。置37 ℃，5% CO2環(huán)境下靜置培養(yǎng)2周。終止培養(yǎng)后棄去上清，用PBS小心浸洗2次，加1∶3醋酸/甲醇5 ml固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染15分鐘，流水緩慢洗去染液，空氣干燥?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，均為獨立重復(fù)三次后取均值，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1靶向抑制FaDu及Cal-27細胞中TBK1蛋白表達檢測結(jié)果 TBK1-siRNA轉(zhuǎn)染舌及下咽鱗癌細胞FaDu、Cal-27后，轉(zhuǎn)染后提取各組細胞總蛋白進行Western Blot檢測，實驗結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染TBK1-siRNA以后，F(xiàn)aDu以及Cal-27的TBK1蛋白表達水平較轉(zhuǎn)染對照組及未轉(zhuǎn)染組明顯下降(P<0.05)。

圖1 Western Blot檢測靶向抑制FaDu、Cal-27細胞中TBK1蛋白表達 a. FaDu及Cal-27在轉(zhuǎn)染了抑制細胞中TBK1蛋白表達的siRNA前后,TBK1蛋白表達的Western Blot結(jié)果;b. FaDu及Cal-27在轉(zhuǎn)染了抑制細胞中TBK1蛋白表達的siRNA前后,TBK1蛋白表達情況的數(shù)據(jù)比較(P<0.05)

2.2靶向抑制FaDu及Cal-27細胞中TBK1蛋白表達后細胞凋亡檢測結(jié)果 采用流式細胞術(shù)分別檢測TBK1-siRNA轉(zhuǎn)染FaDu及Cal-27細胞的凋亡改變，將其與轉(zhuǎn)染對照組及未轉(zhuǎn)染組細胞的凋亡進行對比，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對照組與未轉(zhuǎn)染組相比較，TBK1-siRNA轉(zhuǎn)染組中FaDu及Cal-27細胞凋亡顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2、3)。

圖2 抑制了TBK1的蛋白表達后FaDu下咽鱗癌細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測結(jié)果 a～c.靶向抑制FaDu細胞中的TBK1蛋白表達的siRNA后,FaDu細胞凋亡顯著的增加;d. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,靶向抑制細胞中的TBK1后,FaDu細胞凋亡顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

圖3 抑制了TBK1的蛋白表達后Cal-27舌鱗癌細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測結(jié)果 a～c.靶向抑制細胞中的TBK1后,Cal-27細胞凋亡得到了顯著的增加;d. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,靶向抑制TBK1后,Cal-27細胞凋亡顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.3TBK1蛋白抑制后FaDu及Cal-27細胞增殖能力檢測結(jié)果 采用梯度濃度氨來呫諾處理舌及下咽鱗癌細胞，進行克隆形成以及細胞增殖(CCK-8法)實驗觀察其對舌及下咽鱗癌細胞增殖能力的影響，克隆形成實驗結(jié)果顯示，隨著氨來占諾濃度增加，F(xiàn)aDu及Cal-27細胞系的克隆形成能力顯著下降(圖4)；CCK-8法檢測顯示，隨著氨來占諾濃度增高，F(xiàn)aDu及Cal-27細胞的增殖能力顯著下降(P<0.05)(圖5)。

圖4 克隆形成實驗結(jié)果 隨著氨來占諾濃度增加,FaDu及Cal-27的克隆形成能力顯著下降

圖5 CCK-8法實驗結(jié)果 抑制了TBK1的蛋白表達以后,FaDu及Cal-27細胞增殖能力顯著下降

3 討論

頭頸部惡性腫瘤大約占全身惡性腫瘤的百分之十，其中絕大多數(shù)都是鱗狀細胞癌[10]，其發(fā)病機制以及轉(zhuǎn)歸的研究一直是頭頸腫瘤研究領(lǐng)域的重點和難點。關(guān)于鱗狀細胞癌腫瘤標志物的研究有很多，包括P63[11,12]、CK 5/6[13,14]以及P 40[15]等，很早以前就開始在臨床有所應(yīng)用，但是這些研究以及應(yīng)用，大部分都是集中在乳腺癌或肺癌；而這些鱗癌標志物在舌部、咽部鱗癌中的研究及應(yīng)用較少。因此，探討頭頸部鱗癌特異性腫瘤標志物及靶向治療十分必要。

越來越多的研究表明，TBK1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，尤其是與乳腺癌、非小細胞肺癌等具有顯著的相關(guān)性[16,17]，并且TBK1在腫瘤組織中的蛋白表達水平常常比對照組高。一項有關(guān)膀胱癌與TBK1相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，TBK1蛋白在膀胱癌腫瘤組織中高表達，而且在敲除了TBK1基因以后，膀胱癌腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移也受到了顯著的抑制[5]，這種情況在其他的腫瘤中也有發(fā)現(xiàn)[18]；Liu等[19]發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中，TBK1的蛋白表達水平升高，而mir-203可以通過對TBK1的蛋白表達進行抑制，從而影響骨肉瘤患者的預(yù)后。Wei等[3]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中TBK1蛋白的高表達與乳腺癌的復(fù)發(fā)具有顯著的相關(guān)性。因此，在抑制了TBK1蛋白表達之后，會對頭頸部鱗癌細胞產(chǎn)生什么影響，十分值得研究。

本研究首先采用了轉(zhuǎn)染TBK1-siRNA的方法靶向抑制TBK1的表達，結(jié)果顯示在抑制了TBK1的蛋白表達以后，F(xiàn)aDu及Cal-27細胞凋亡都顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明TBK1或許是頭頸部鱗癌潛在的靶向治療目標之一。一項有關(guān)肺癌的研究結(jié)果顯示，TBK1也是一種有絲分裂調(diào)節(jié)器，TBK1基因的敲除可以使異粘蛋白的磷酸化減少，從而對腫瘤細胞的生長進行抑制，并且同時促進腫瘤細胞的凋亡[20]，本研究結(jié)果與此類似。為了進一步說明TBK1在舌及下咽鱗癌細胞增殖調(diào)控中的作用，本研究還采用TBK1抑制劑氨來呫諾進行了實驗，梯度濃度的氨來呫諾處理頭頸鱗癌細胞后，采用CCK-8法及克隆形成實驗檢測其對增殖的影響，結(jié)果提示隨著氨來呫諾的濃度增加，F(xiàn)aDu及Cal-27細胞增殖都受到了顯著的抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，對TBK1蛋白表達進行抑制以后，舌及下咽部鱗癌細胞的增殖能力明顯降低，細胞凋亡顯著增加，提示TBK1的表達在舌及下咽部鱗癌細胞的增殖中發(fā)揮重要作用，藥物氨來呫諾作用后可以明顯抑制舌及下咽鱗癌細胞的克隆形成能力。