疏風(fēng)止痙方對耐藥性癲癇大鼠腦組織NF-κB p65表達的影響及腦脊液卡馬西平濃度影響*

戎 萍，閆 融，馬茗晗，張喜蓮，馬 融

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，天津 300193）

近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)不僅是癲癇誘導(dǎo)的結(jié)果，還是引起癲癇發(fā)生、發(fā)展的最重要機制[1]，且炎性因子可提高P糖蛋白（P-gp）多藥耐藥的表達，從而阻斷抗癲癇西藥進入腦內(nèi)，不能發(fā)揮抗癇作用。中藥復(fù)方疏風(fēng)止痙方是由導(dǎo)師馬融教授根據(jù)“疏風(fēng)解表、開通經(jīng)絡(luò)”的治療原則，由銀翹散化裁而來。銀翹散本為治療風(fēng)熱外感的有效方劑，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的作用[2]，西醫(yī)學(xué)認為具有抗炎的作用[3]，且有研究表明以疏風(fēng)為主的銀翹散可降低炎癥信號通路NF-κB相關(guān)蛋白的表達[4]，并可調(diào)節(jié)NF-κB炎癥信號通路上下游細胞因子的水平[5-6]，降低P-gp的表達，從而提高腦脊液中卡馬西平的濃度，來達到逆轉(zhuǎn)耐藥性癲癇的目的。本實驗擬從研究疏風(fēng)止痙方對耐藥性癲癇大鼠海馬NF-κB、P-gp的表達及腦脊液中卡馬西平濃度的影響，觀察疏風(fēng)止痙方是否可以提高腦內(nèi)抗癇藥物的濃度，為臨床中藥復(fù)方添加治療耐藥性癲癇提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SD大鼠100只，體質(zhì)量（80±5）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實驗藥品及試劑 氯化鋰（批號為115K1308，100 g/瓶，美國Sigma公司）；阿托品（批號為國藥準字 H12020382，0.5 mg/mL×10 支/盒，天津金耀藥業(yè)有限公司）；鹽酸匹羅卡品（批號為S31556，100 mg/瓶，美國Sigma公司）；地西泮注射液（批號為國藥準字0804032，每2 mL含10 mg，天津金耀氨基酸有限公司）；卡馬西平（批號為國藥準字H11022279，200 mg/片，北京諾華制藥公司）；丙戊酸鈉口服液（批號為國藥準字 H20041435，300 mL，12 g/瓶，賽諾菲制藥有限公司）；吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC，批號為 S30342，25 g/瓶，美國 Sigma公司）；疏風(fēng)止痙方飲片（由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供）。

2 實驗方法

2.1 點燃癲癇大鼠模型 100只大鼠隨機選取10只作為正常對照組。其余90只采用氯化鋰-匹羅卡品點燃癲癇發(fā)作。采用Racine6級評價標準：0級：無反應(yīng)；Ⅰ級：耳、面部肌肉抽搐；Ⅱ級：肌陣攣，但無直立位；Ⅲ級：肌陣攣，伴直立位；Ⅳ級：全身強直陣攣發(fā)作；Ⅴ級：全身強直陣攣發(fā)作，并失去體位控制。癇性發(fā)作達到Ⅳ級及以上，解除癇性發(fā)作后存活狀態(tài)良好的大鼠為合格癲癇模型大鼠。在點燃過程中大鼠死亡8只，未達到級別9只，剩余73只進行耐藥癲癇模型的建立。

2.2 建立耐藥性癲癇大鼠模型 將存活良好的癲癇模型大鼠先經(jīng)過14 d丙戊酸鈉預(yù)處理，篩選出每周發(fā)作次數(shù)大于10次的大鼠，作為耐丙戊酸鈉癲癇大鼠。再將耐丙戊酸鈉癲癇大鼠經(jīng)過14 d卡馬西平預(yù)處理，篩選出每周發(fā)作次數(shù)大于10次的癲癇大鼠，將耐丙戊酸鈉及卡馬西平癲癇大鼠作為耐藥性癲癇大鼠模型。在建立耐藥癲癇模型過程中，有11只大鼠因解痙無效死亡，12只每周發(fā)作次數(shù)少于10次，成功篩選的耐藥癲癇模型50只。

2.3 分組及給藥 將未造模的正常大鼠與篩選出的50只耐藥癲癇模型大鼠分為6組：1）正常對照組：生理鹽水按10 mL/kg/次，灌胃，每天2次。2）耐藥模型組：卡馬西平按15 mg/kg/次，灌胃，每天2次。3）陽性對照組：先后予NF-κB特異性抑制吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC）75 mg/kg/次、卡馬西平15 mg/kg/次，灌胃，兩種藥物間隔30 min，每天2次。4）疏風(fēng)止痙方低劑量組：先后予低劑量疏風(fēng)止痙方按生藥含量2 g/mL配置成溶液10 mL/kg/次、卡馬西平15 mg/kg/次，灌胃，兩種藥物間隔30 min，每天2次。5）疏風(fēng)止痙方中劑量組：先后予中劑量疏風(fēng)止痙方按生藥含量4 g/mL配置成溶液10 mL/kg/次、卡馬西平15 mg/kg/次，灌胃，兩種藥物間隔30 min，每天2次。6）疏風(fēng)止痙方高劑量組：先后予高劑量疏風(fēng)止痙方按生藥含量6 g/mL配置成溶液10 mL/kg/次、卡馬西平15 mg/kg/次，灌胃，兩種藥物間隔30 min，每天2次。各組灌胃均持續(xù)28 d。

2.4 監(jiān)測各組大鼠發(fā)作情況 采用影像監(jiān)控系統(tǒng)對所有實驗大鼠全程監(jiān)控并觀察各組大鼠反復(fù)自發(fā)性發(fā)作（SRS）的情況。

2.5 免疫組化法檢測海馬NF-κBp65及腦組織P-gp分布 取各組大鼠腦組織甲醛固定、石蠟包埋，切片后進行脫蠟、入水清洗，依次滴加第一抗體、第二抗體后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木素染色封片。

2.6 蛋白免疫印跡法檢測海馬NF-κBp65及腦組織P-gp蛋白表達 提取各組大鼠組織目標蛋白樣品，進行凝膠、電泳、轉(zhuǎn)模、封閉、一抗孵育、二抗孵育后進行檢測。

2.7 高效液相發(fā)檢測腦脊液卡馬西平濃度 大鼠頭部剃毛清潔，固定于腦立體定位儀：68002，顱骨處于水平位，頭部開小口，暴露顱骨表面。左側(cè)海馬定位坐標處，用STRONG90+102顱骨鉆鉆顱打孔，插入探針導(dǎo)管。以人工腦脊液Ⅰ沖洗1小時后收集樣品，立即轉(zhuǎn)存入-80℃冰箱保存。分別以水-甲醇-乙腈=45:45:10為溶劑，配制濃度為0.250、1.000、3.000、5.000、7.500、10.000 μg/mL 的溶液繪制標準曲線，用以日本島津高效液相色譜儀按色譜條件對各實驗組大鼠腦脊液卡馬西平進行測定。

2.8 統(tǒng)計方法 使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均值±標準差（）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布和方差不齊的數(shù)據(jù)組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠癇性自主發(fā)作情況 除正常對照組以外，其他各組大鼠均有癲癇發(fā)作；與耐藥模型組比較，陽性對照組發(fā)作次數(shù)雖然有所減少，但兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，而與疏風(fēng)止痙方各劑量組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；隨著中藥劑量的增加，發(fā)作次數(shù)呈遞減趨勢，且各組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表1。

表1 疏風(fēng)止痙方對耐藥性癲癇大鼠SRS的影響（）Tab.1 Effect of Shufeng Zhijing Prescription on SRS in rats with drug resistant epilepsy（）

表1 疏風(fēng)止痙方對耐藥性癲癇大鼠SRS的影響（）Tab.1 Effect of Shufeng Zhijing Prescription on SRS in rats with drug resistant epilepsy（）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與耐藥模型組比較，□P<0.05；與陽性對照組比較，△P<0.05；與疏風(fēng)止痙方低劑量組比較，#P<0.05；與疏風(fēng)止痙方中劑量組比較，▲P<0.05。

組別 動物數(shù) SRS發(fā)作次數(shù)正常對照組 10 0耐藥模型組 10 17.3±2.75*陽性對照組 10 15.4±2.67*疏風(fēng)止痙方低劑量組 10 12.2±2.25*□△疏風(fēng)止痙方中劑量組 10 9.2±2.53*□△#疏風(fēng)止痙方高劑量組 10 6.4±2.41*□△#▲

3.2 免疫組化法檢測海馬NF-κBp65及腦組織P-gp分布 免疫組化評分以5個視野內(nèi)陽性細胞數(shù)即IHS為評分標準：A為陽性細胞數(shù)分級，其中，0%=0、1～10%=1、11～50%=2、51～80%=3、81～100%=4；B為陽性細胞顯色強度分級，其中，無著色為0，淡黃色為 1，棕黃色為 2，棕褐色為 3；則 IHS=A×B，將染色結(jié)果分為 4級：0～2為陰性表達（-）；IHS≥3為陽性表達：3～4為弱陽性（+），6～8為陽性（++），9～12為強陽性（+++）。

3.2.1 NF-κBp65的分布表達 各組NF-κB陽性細胞的表達分為4級（陰性-、弱陽性+、陽性++、強陽性+++），均未出現(xiàn)強陽性；各組間比較存在顯著性差異（P＜0．05），組間兩兩比較，耐藥模型組（2例+、4例++）及疏風(fēng)止痙方低劑量組（1例-、1例+、4例++）與正常對照組（4例-，2例+）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）；疏風(fēng)止痙方高劑量組陽性表達例數(shù)（1例-、3例+、2例++）低于疏風(fēng)止痙方低劑量組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。見圖 1。

圖1 各組NF-κB陽性表達情況Fig.1 NF-κB positive expression in each group

3.2.2 P-gp分布表達 各組P-gp分布表達分為4 級（陰性-、弱陽性+、陽性++、強陽性+++），正常對照組（3例-、3例+）與疏風(fēng)止痙方高劑量組（1例-、2 例+、3 例++）無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）；疏風(fēng)止痙方高劑量組表達水平低于耐藥模型組、疏風(fēng)止痙方低劑量組、疏風(fēng)止痙方中劑量組（均為2例+、4例++），無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。見圖 2。

圖2 各組P-gp的表達情況Tig.2 Expression of P-gp in each group

3.3 Western blot法檢測海馬NF-κBp65及腦組織P-gp蛋白表達

3.3.1 海馬NF-κBp65蛋白表達 與耐藥模型組相比，陽性對照組NF-κB p65蛋白表達稍低，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）；中藥各劑量組蛋白表達均低于耐藥模型組及陽性對照組，且有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），隨著中藥劑量的增加，NF-κB p65 蛋白表達量呈遞減趨勢，且疏風(fēng)止痙方高劑量組、疏風(fēng)止痙方中劑量組與疏風(fēng)止痙方低劑量組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。見圖 3、表 2。

圖3 各組NF-κBp65、P-gp蛋白定量灰度圖Tig.3 Quantitative grayscale map of NF-κBp65 and P-gp proteins in each group

表2 各組NF-κB p65及P-gp蛋白表達（）Tab.2 Expression of NF-κB p65 and P-gp proteins in each group（）

表2 各組NF-κB p65及P-gp蛋白表達（）Tab.2 Expression of NF-κB p65 and P-gp proteins in each group（）

注：與正常對照組比較，*P＜0．05；與耐藥模型組比較，#P＜0．05；與陽性對照組比較，△P＜0．05；與疏風(fēng)止痙方低劑量組比較，□P＜0．05；與疏風(fēng)止痙方中劑量組比較，▲P＜0．05。

分組 動物數(shù) NF-κBp65 P-gp正常對照組 6 0．51±0．53 0．13±0．05耐藥模型組 6 1．08±0．04* 0．62±0．06*陽性對照組 6 1．05±0．2* 0．53±0．08*#疏風(fēng)止痙方低劑量組 6 0．84±0．07*#△ 0．52±0．04*#疏風(fēng)止痙方中劑量組 6 0．8±0．09*#△ 0．45±0．06*#疏風(fēng)止痙方高劑量組 6 0．66±0．09*#△□▲ 0．43±0．11*#△□

3.3.2 腦組織P-gp蛋白表達 與耐藥組比較，其他各組P-gp蛋白表達均有所下降，且有顯著性差異（P＜0．05）；與對照組比較，疏風(fēng)止痙方各劑量組蛋白表達量均有所下降，但只與疏風(fēng)止痙方高劑量組有顯著性差異（P＜0．05）；疏風(fēng)止痙方各劑量組隨著中藥劑量增加蛋白表達量呈遞減趨勢，且疏風(fēng)止痙方高劑量組與疏風(fēng)止痙方低劑量組有顯著差異（P<0．05）。見圖 3、表 2。

3.4 高效液相法檢測腦脊液卡馬西平濃度 除正常對照組，與耐藥模型組比較，各組腦脊液卡馬西平濃度均升高，但只與陽性對照組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01）；與陽性對照組比較，疏風(fēng)止痙方各劑量組腦脊液卡馬西平濃度均降低，與疏風(fēng)止痙方低劑量組、疏風(fēng)止痙方中劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）；疏風(fēng)止痙方各劑量組隨著中藥劑量的增加，腦脊液中卡馬西平濃度呈遞增趨勢，疏風(fēng)止痙方中劑量組比疏風(fēng)止痙方低劑量組平均升高15．38%，疏風(fēng)止痙方高劑量組比疏風(fēng)止痙方中劑量組平均升高20%，3 組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），見表 3。

表3 各實驗組大鼠腦脊液中卡馬西平濃度（）Tab.3 Level of carbamazepine in cerebrospinal fluid of each group（） μg/mL

表3 各實驗組大鼠腦脊液中卡馬西平濃度（）Tab.3 Level of carbamazepine in cerebrospinal fluid of each group（） μg/mL

分組 動物數(shù) 濃度耐藥模型組 4 0．64±0．13陽性對照組 4 1．06±0．20疏風(fēng)止痙方低劑量組 4 0．65±0．15疏風(fēng)止痙方中劑量組 4 0．75±0．24疏風(fēng)止痙方高劑量組 4 0．90±0．23

4 討論

癲癇是兒科常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。經(jīng)過正規(guī)中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合治療有70%～80%的癲癇可得到有效控制，但仍有30%左右成為耐藥性癲癇[7]。癲癇患者治療不夠及時使病程拖延長久是引起癲癇耐藥的危險因素[8-9]，并且有研究[10-11]報道，癲癇患者首次治療前發(fā)作頻繁也是造成癲癇耐藥的重要因素。臨床研究發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇的特征表現(xiàn)是，如果患者對一種抗癲癇藥物耐受，往往也對其他抗癲癇藥物不敏感，即使這些藥物的作用機制、分子結(jié)構(gòu)不同[12]。耐藥性癲癇的形成嚴重影響患兒認知功能，降低生活質(zhì)量。近年來，有大量研究發(fā)現(xiàn)癲癇動物模型和癲癇患者腦組織中及外周血中均有顯著的炎性反應(yīng)現(xiàn)象，白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）等以細胞因子為主的炎性介質(zhì)顯著異常表達[13-14]。而炎性細胞因子和神經(jīng)系統(tǒng)興奮活性遞質(zhì)可激活NF-κB，通過促進相關(guān)基因表達可進一步促使炎性細胞因子合成與釋放。長時期TNF-α的刺激可使多藥耐藥P糖蛋白的表達和轉(zhuǎn)運功能被激活[15]。近年來研究報道證實大部分AEDs是P-gp的底物[16]，在病理情況下，過度表達的P-gp與抗癲癇藥物結(jié)合，將藥物從細胞內(nèi)泵入血液中，使藥物無法發(fā)揮藥效，從而產(chǎn)生耐藥機制。

疏風(fēng)止痙方由馬融教授根據(jù)銀翹散化裁而來。中醫(yī)認為，難治性癲癇病程日久，痰、熱、瘀等病理因素長期伏留，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)癲癇反復(fù)發(fā)作引發(fā)炎癥反應(yīng)。由銀翹散化裁而來的疏風(fēng)止痙方主要由：金銀花、連翹、荊芥穗、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、淡竹葉、薄荷、蘆根、甘草、金果欖、全蝎組成。銀翹散原方具有疏風(fēng)解表、開通經(jīng)絡(luò)的功效，不但使邪有出路，還能助藥直達病所，此外方中加入金果欖清熱利咽，并以全蝎加強通絡(luò)止痙之功。全方共奏疏風(fēng)止痙、清熱通絡(luò)之功效。正如《幼幼集成》云：“凡小兒諸般癇證，先服消風(fēng)丸七服。此非治癇之藥，用以疏散外感，開通經(jīng)絡(luò)，庶后藥得以流通故而?！爆F(xiàn)代藥理研究顯示，金銀花、連翹的有效成分有較強的抗炎作用，且金銀花可以顯著抑制NF-κB的激活及從細胞質(zhì)到細胞核的易位并抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性[17-18]。全蝎抗癲癇的機制可能是全蝎醇提物可以減少大鼠海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白mRNA的表達[19]。

前期臨床研究觀察發(fā)現(xiàn)由銀翹散化裁而來的疏風(fēng)止痙方可有效控制難治性癲癇的發(fā)作[20-22]。本實驗研究結(jié)果顯示：1）疏風(fēng)止痙方聯(lián)合卡馬西平可有效控制癲癇發(fā)作次數(shù)，且表明隨著疏風(fēng)止痙方劑量的增加，發(fā)作次數(shù)顯著減少（有統(tǒng)計學(xué)意義）。這提示在臨床中治療耐藥性癲癇時可在一定范圍內(nèi)增加中藥復(fù)方的劑量來控制癲癇的發(fā)作。2）疏風(fēng)止痙方聯(lián)合卡馬西平治療耐藥性癲癇大鼠隨著中藥劑量的增加，腦脊液中卡馬西平濃度呈遞增趨勢（無統(tǒng)計學(xué)意義），疏風(fēng)止痙方中劑量組比中低組平均升高15．38%，疏風(fēng)止痙方高劑量組比疏風(fēng)止痙方中劑量組平均升高20%。綜上所述，中藥復(fù)方聯(lián)合抗癇藥物可提高腦內(nèi)抗癇藥物濃度，減少癲癇發(fā)作次數(shù)。