超聲輔助分步結晶法制備高純度豆甾醇的工藝研究

馮文歡，吳正章，張 鵬，常 明，金青哲，王興國

(1.江南大學 食品學院，國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122； 2.江蘇科鼐生物制品有限公司，江蘇 泰興 225400)

植物甾醇是一類以環(huán)戊烷全氫菲為基本骨架的天然活性化合物[1]，廣泛存在于各類植物種子、堅果和植物油中，主要包括菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等。植物甾醇具有降低機體總血清膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[1-2]、降低心臟疾病風險[3]、抗氧化[4]、消炎[5]和抗癌[6]等生理功能。近年來，植物甾醇在食品、醫(yī)藥和化工等領域受到廣泛關注，截至2015年全球植物甾醇的需求量高達1.8萬t左右[7]，且以豆甾醇為原料合成的甾體藥物需求量大幅提升[8]。如何有效分離高純度豆甾醇并規(guī)?；a(chǎn)，以滿足市場需求具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。

目前，由于高純度豆甾醇的價格高昂，降低豆甾醇制備成本是工業(yè)化生產(chǎn)亟待解決的問題。常見的植物甾醇分離純化方法主要有化學衍生法、色譜法和溶劑結晶法等?；瘜W衍生法將植物甾醇衍生化，增大各甾醇單體間的物性差異后再進行分離，但此工藝步驟煩瑣，成本高且產(chǎn)率低，難以規(guī)?；a(chǎn)[9]；色譜法主要利用制備級液相色譜通過優(yōu)化流動相配比達到分離各甾醇單體的目的，此法色譜純級溶劑消耗量大且制備量小，工業(yè)化生產(chǎn)成本高[10-11]；溶劑結晶法利用植物甾醇單體之間顯著的溶解度差異，通過升溫降溫促使飽和溶液體系中豆甾醇率先結晶析出，此法雖結晶次數(shù)較多，但制備工藝易于工業(yè)化生產(chǎn)且產(chǎn)品純度較高。目前的溶劑結晶法主要采用單一溶劑如環(huán)己酮[12]、正戊醇[13]、正丁醇[14]等非極性溶劑進行多次結晶，其純度往往無法再通過增加結晶次數(shù)得到更高純度的豆甾醇產(chǎn)品，且豆甾醇得率較低。研究表明：液體介質(zhì)經(jīng)超聲處理后，由渦流或超聲波產(chǎn)生的“空化”作用能夠促進晶體成核，提高晶體生長速率并防止晶體聚集，縮短結晶時間并提高結晶產(chǎn)率；而且超聲處理能夠改變晶體粒度，縮短結晶過濾周期，加快晶體干燥速度，大大縮短豆甾醇的生產(chǎn)工藝周期[15-16]。

本文采用超聲輔助分步結晶法，富集階段篩選出環(huán)己酮為結晶溶劑，經(jīng)5次結晶富集得到純度95%左右的豆甾醇粗品；精制階段篩選出丙酮為結晶溶劑，引入超聲輔助處理以提高精制過程中豆甾醇的得率，最終獲得純度99%以上豆甾醇產(chǎn)品。本文通過單因素實驗探究了豆甾醇純化過程中料液比、養(yǎng)晶時間、養(yǎng)晶溫度、超聲時間和超聲功率等條件，為工業(yè)化生產(chǎn)高純度豆甾醇提供了解決方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

98%植物甾醇(豆甾醇約占30.9%)，由江蘇科鼐生物制品有限公司提供；正己烷為色譜純，購自百靈威科技有限公司；環(huán)己酮、丙酮等試劑及藥品均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；BSTFA+TMCS(99∶1)硅烷化試劑,購自百靈威科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

EL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；QGC-12T氮氣吹干儀，上海泉島公司；循環(huán)水式多用真空泵，上海瀘西分析儀器有限公司；DHX-3015低溫恒溫槽，南京舜瑪儀器設備有限公司；ZK-82BB型電熱真空干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司；GC-MS(ISQ)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo Fisher公司；Nexus傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；AdvanceⅢ 400MW全數(shù)字化核磁共振波譜儀，德國布魯克AXS有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆甾醇的富集

取50 g植物甾醇與非極性溶劑按一定配比加至250 mL夾層酶反應器中，連接低溫恒溫槽，開啟循環(huán)水浴加熱至65℃，充分攪拌直至樣品完全溶解后，恒溫平衡30 min后降溫至一定溫度，養(yǎng)晶，抽濾，濾餅真空干燥至恒重，稱重。所得晶體用上述方法反復結晶，實現(xiàn)豆甾醇的富集。

1.2.2 豆甾醇的精制

取10 g豆甾醇富集產(chǎn)物與極性溶劑按一定配比加至100 mL圓底燒瓶中加熱至60℃，充分攪拌直至樣品完全溶解后，靜置平衡30 min，置于超聲波清洗器中，保持超聲溫度60℃，用不同的超聲功率處理一段時間后，將圓底燒瓶在一定溫度下靜置養(yǎng)晶，抽濾，濾餅真空干燥至恒重，稱重。將所得晶體用上述方法反復結晶，實現(xiàn)豆甾醇的精制。

1.2.3 豆甾醇純度的測定

樣品預處理：稱取5 mg豆甾醇樣品于10 mL容量瓶，用正己烷稀釋至刻度。取0.1 mL溶液于2 mL離心管內(nèi)，氮氣吹干溶劑，加入200 μL硅烷化試劑，置于75℃水浴內(nèi)30 min，過0.22 μm有機濾膜，進樣檢測，依據(jù)峰面積歸一化法測定樣品純度。

氣相色譜條件：DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序為200℃保持0.5 min，10℃/min升溫至300℃，保持18 min；檢測器溫度和進樣口溫度均為280℃；進樣量1.0 μL；分流比100∶1；載氣為99.99%氦氣，載氣流速1.2 mL/min；程序運行時間為28.5 min。

1.2.4 豆甾醇得率計算

豆甾醇得率=結晶樣品質(zhì)量×結晶樣品中豆甾醇的純度/(結晶原料質(zhì)量×結晶原料中豆甾醇的純度)×100%。

1.2.5 結構鑒定

紅外光譜(FT-IR)：將分離提純制得的豆甾醇充分干燥后，使用KBr壓片法，掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm-1。

核磁(1H NMR)：通過核磁共振譜儀分別對豆甾醇進行氫譜的分析，以氘代氯仿為溶劑，在400 MW條件下進行測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

每組實驗平行測定3次，求平均值，實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準偏差”表示。使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)計算不同參數(shù)下的顯著性差異，P<0.05表示組間數(shù)據(jù)在0.05水平上存在顯著性差異，以a、b、c表示。

2 結果與討論

2.1 豆甾醇富集工藝的單因素實驗

2.1.1 溶劑的選擇

控制料液比1∶4、養(yǎng)晶溫度25℃、養(yǎng)晶時間24 h，選取正丙醇、正戊醇、異戊醇、環(huán)己酮、正丁醇和異丁醇作為結晶溶劑，考察溶劑對豆甾醇富集效果的影響，結果見圖1。

圖1 溶劑種類對豆甾醇純度的影響

由圖1可知，6種溶劑均具備富集豆甾醇的能力，其中環(huán)己酮的富集效果最佳，因此選擇環(huán)己酮作為豆甾醇富集過程的溶劑。

2.1.2 料液比的選擇

控制養(yǎng)晶溫度25℃、養(yǎng)晶時間24 h，考察不同料液比對豆甾醇純度和得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 料液比對豆甾醇純度和得率的影響

由圖2可知，隨料液比增大，豆甾醇的純度整體呈增大趨勢，當料液比大于1∶3.5時，豆甾醇純度增大不顯著。這是因為溶劑用量越大，結晶體系過飽和度越低，較好的晶體完整性有利于甾醇純度的提升；在料液比小于1∶3.5時，由于體系過飽和度較大，導致晶體產(chǎn)生快速不均勻性生長現(xiàn)象，大量純度較低的晶體析出導致整個體系黏稠，增加結晶抽濾和去除溶劑的難度；而當料液比介于1∶3.5～1∶4時，豆甾醇純度相對于較低料液比時顯著提高且得率仍為57%左右。綜合考慮，選擇1∶3.5為豆甾醇富集的最佳料液比。

2.1.3 養(yǎng)晶溫度的選擇

選取料液比1∶3.5、養(yǎng)晶時間24 h，考察不同養(yǎng)晶溫度對豆甾醇純度和得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 養(yǎng)晶溫度對豆甾醇純度和得率的影響

由圖3可知，豆甾醇純度隨養(yǎng)晶溫度的升高先緩慢提升后降低，得率隨養(yǎng)晶溫度升高而降低，尤其30℃時得率相比于20～25℃時顯著下降約25個百分點。養(yǎng)晶溫度直接涉及是否需要加熱設備，綜合考量純度、得率及溫度對規(guī)?；a(chǎn)設備的需求，選取養(yǎng)晶溫度25℃較合適。

2.1.4 養(yǎng)晶時間的選擇

選取料液比1∶3.5、養(yǎng)晶溫度25℃，考察不同養(yǎng)晶時間對豆甾醇純度和得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 養(yǎng)晶時間對豆甾醇純度和得率的影響

由圖4可知，隨養(yǎng)晶時間的延長，豆甾醇純度呈緩慢上升趨勢，而得率先升高再降低。當養(yǎng)晶至16～20 h時，豆甾醇純度和得率均無顯著變化。綜合考慮，養(yǎng)晶時間控制在16 h較為合適。

根據(jù)上述單因素實驗結果，得到富集過程最優(yōu)工藝條件為：以環(huán)己酮為溶劑，料液比1∶3.5，養(yǎng)晶溫度25℃，養(yǎng)晶時間16 h。在最佳條件下，經(jīng)過重復5次富集，制備得到了純度達到94.69%的豆甾醇粗品，并以此粗品為原料進行豆甾醇的精制結晶制備工藝探究。

2.2 豆甾醇精制工藝的單因素實驗

實驗結果表明環(huán)己酮作為溶劑無法進一步提高產(chǎn)物純度。據(jù)專利[17]報道非極性溶劑體系難以分離純化高純度的豆甾醇，因此通過改變?nèi)軇w系，實現(xiàn)豆甾醇的精制。

2.2.1 溶劑的選擇

控制料液比1∶65、養(yǎng)晶溫度25℃、養(yǎng)晶時間4 h，考察甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、異丙醇5種極性溶劑對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖5所示。

圖5 溶劑種類對豆甾醇純度的影響

由圖5可知，使用甲醇、乙腈和乙醇結晶后的豆甾醇純度降低，無精制效果，異丙醇僅提升豆甾醇純度不足1個百分點，而丙酮能夠顯著提高豆甾醇純度2.5個百分點，起到精制豆甾醇的目的。因此，后續(xù)實驗采用丙酮作為溶劑進行豆甾醇的精制。

2.2.2 超聲時間的選擇

圖6 超聲時間對豆甾醇純度和得率的影響

由圖6可知，與未進行超聲處理的實驗組進行比較，豆甾醇得率顯著提高。這是由于超聲波產(chǎn)生的“空化”作用，縮短了從過飽和態(tài)到晶核形成并析出晶體之間的誘導期，加快了晶體的生長速率，促使得率顯著提高；同時，“空化”作用產(chǎn)生的空化氣泡能侵蝕剝落晶體外表面的雜質(zhì)層，降低由于雜質(zhì)包裹引起晶體的各向生長異性，從而伴隨豆甾醇晶體析出的雜質(zhì)分子較少，因此純度提高[15]。當超聲時間為3 min時，甾醇純度提升至最高的97.86%，而得率提升至54.30%，繼續(xù)延長超聲時間，豆甾醇得率趨于穩(wěn)定，而豆甾醇純度降低，因此選擇超聲時間為3 min進行后續(xù)實驗。

2.2.3 超聲功率的選擇

控制料液比1∶65、超聲時間3 min、養(yǎng)晶溫度25℃、養(yǎng)晶時間4 h，考察不同超聲功率對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖7所示。

圖7 超聲功率對豆甾醇純度和得率的影響

由圖7可知，隨著超聲功率的提高，豆甾醇得率、純度先升高后降低。當超聲功率分別為80、90 W時，豆甾醇純度和得率分別達到最大。這是因為提高超聲功率晶體的粒度減小，晶體粒度減小雖可防止晶體聚結并縮短結晶時間，但過小的晶體粒度也會增加單位晶體的生長時間，從而在相同養(yǎng)晶時間內(nèi)晶體析出量減少，得率降低[18]，且過小的粒度易重新聚集并包裹雜質(zhì)，從而導致純度下降。綜合考慮，超聲功率為90 W較合適。

2.2.4 料液比的選擇

控制超聲時間3 min、超聲功率90 W、養(yǎng)晶溫度25℃、養(yǎng)晶時間4 h，考察不同料液比對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖8所示。

圖8 料液比對豆甾醇純度和得率的影響

在結晶體系中，料液比越大，過飽和度越小，溶劑體系更有利于晶核的有序生長，且晶體依附于晶核緩慢生長形成完整性較好的晶體往往純度也較高，但是晶體析出緩慢也是得率偏低的原因之一。反之，高過飽和度增大了體系的傳質(zhì)阻力，晶體趨于不均勻性生長，雖然晶體的快速析出促使了得率的顯著提高，但雜亂無序的晶體快速生長所包藏的母液、非目標晶體和雜質(zhì)等也直接導致了純度的較低。由圖8可知，隨著料液比的增大，豆甾醇得率顯著下降，而純度逐步提升后趨于平緩，當料液比為1∶70時，純度達到97.4%左右，且得率并未顯著下降。綜合考慮，選擇1∶70為豆甾醇精制的最佳料液比。

機車無動力回送中，由于其空氣壓縮機無電停止使用，此時必須開放機車無動力裝置。無動力裝置由：DE無動力塞門、DER壓力調(diào)整閥、C2充風節(jié)流孔、CV單向止回閥等部分組成。

2.2.5 養(yǎng)晶溫度的選擇

控制料液比1∶70、超聲時間3 min、超聲功率90 W、養(yǎng)晶時間4 h，考察不同養(yǎng)晶溫度對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖9所示。

圖9 養(yǎng)晶溫度對豆甾醇純度和得率的影響

由圖9可知，隨養(yǎng)晶溫度升高，豆甾醇純度增大，得率降低。當養(yǎng)晶溫度為15℃時，豆甾醇得率高達68%左右，但其純度僅為96.5%左右，說明溫度過低促使體系溫差擴大，晶體快速形成的同時，其余雜質(zhì)被晶體包裹而析出；反之養(yǎng)晶溫度的升高縮小了體系溫差，減緩結晶速率，純度隨之顯著提高?？梢园l(fā)現(xiàn)，豆甾醇純度在30℃時達到頂峰，但得率較之于25℃顯著下降，且25～35℃區(qū)間內(nèi)純度并無顯著差異。因此，接近常溫的25℃為較合適的養(yǎng)晶溫度。

2.2.6 養(yǎng)晶時間的選擇

選取料液比1∶70、超聲時間3 min、超聲功率90 W、養(yǎng)晶溫度25℃，考察不同養(yǎng)晶時間對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖10所示。

圖10 養(yǎng)晶時間對豆甾醇純度和得率的影響

由圖10可知，3 h前隨養(yǎng)晶時間延長，豆甾醇得率不斷提高，純度先增大后降低，但無顯著性變化,然而3 h后豆甾醇純度和得率均呈下降趨勢。這可能是由于豆甾醇晶體已完全析出，而非目標溶質(zhì)附著于豆甾醇晶體表面形成的共結晶現(xiàn)象所致。因此，選擇3 h為豆甾醇精制的養(yǎng)晶時間較為合適。

根據(jù)上述單因素實驗結果，選擇丙酮為溶劑，料液比1∶70，養(yǎng)晶溫度25℃，養(yǎng)晶時間3 h，超聲時間3 min，超聲功率90 W對豆甾醇進行2次精制，豆甾醇純度達到了99.36%，其GC-MS譜圖見圖11。

圖11 豆甾醇的GC-MS譜圖

2.3 結構鑒定

2.3.1 MS(見圖12)

一般含有羥基(—OH)和氨基(—NH2)的化合物都能被三甲基硅烷化，常用符號“TMS(Trimethylsiyl)”表示。如圖12所示，豆甾醇(ST)經(jīng)衍生化后，會形成其硅烷化衍生物ST-TMS。ST-TMS在質(zhì)譜條件下，羥基中的氧會獲得一個質(zhì)子，從而形成[ST-TMS+H]+母離子(m/z484.46)。母離子丟失一個TMS-OH后，會形成相應的[ST-TMS+H—TMS-OH]+(m/z394.41)；丟失側鏈和TMS-OH后，會形成相應的[ST-TMS+H—TMS-OH—side chain]+(m/z255.20)。圖11中，保留時間為13.88 min的物質(zhì)相應的質(zhì)譜圖可以找到離子m/z484.46、m/z394.41和m/z255.20，可以鑒定其對應的產(chǎn)物為豆甾醇。

2.3.2 FT-IR(見圖13)

經(jīng)與文獻[20]對照發(fā)現(xiàn)，該樣品存在豆甾醇的特征吸收峰，如970 cm-1和960 cm-1，說明上述工藝所得高純度樣品為豆甾醇。

圖12 豆甾醇的MS譜圖

圖13 豆甾醇的FT-IR譜圖

2.3.3 NMR

為了進一步驗證結晶產(chǎn)品為豆甾醇，通過核磁共振對樣品進行了結構表征。圖14為豆甾醇的1H NMR譜圖及分子結構示意圖。

豆甾醇1H NMR(400 MW，CDCl3)圖解：1H NMR(400 MW，Chloroform-d)δ5.35(d，J=5.3 W，1H)，δ5.15(dd，J=15.1、8.6 W，1H)，δ5.02(dd，J=15.2、8.6 W，1H)，δ3.52(s，1H)，δ2.35～2.18(m，2H)，δ2.11～1.92(m，3H)，δ1.91～1.77(m，2H)，δ1.70(ddd，J=14.6、9.3、5.5 W，1H)，δ1.59～1.40(m，12H)，δ1.28～0.90(m，13H)，δ0.88～0.77(m，8H)，δ0.70(s，3H)。

豆甾醇的C6、C22、C23、C3上的氫對應的化學位移分別為5.35、5.15、5.02和3.52，質(zhì)量比為1.21∶1.16∶1.08∶1.23，約為1∶1∶1∶1，且由豆甾醇1H NMR(400 MW，CDCl3)圖解可知，積分圖14所得氫原子與豆甾醇分子結構式理論氫原子數(shù)相同，并與文獻[3,21]核磁分析數(shù)據(jù)相符，符合豆甾醇結構式。

圖14 豆甾醇的1H NMR譜圖及分子結構示意圖

3 結 論

通過多級分步結晶法將豆甾醇純化分為富集和精制兩步工藝，富集工藝探究非極性溶劑的篩選、料液比、養(yǎng)晶溫度和養(yǎng)晶時間對目標物純度和得率的影響。單因素實驗確定最佳的豆甾醇富集條件為：以環(huán)己酮為結晶溶劑，料液比1∶3.5，養(yǎng)晶溫度25℃，養(yǎng)晶時間16 h。在最佳富集條件下重復結晶5次，豆甾醇的純度達到94.69%。輔以超聲輔助進一步精制豆甾醇，單因素實驗結果表明在以丙酮為精制溶劑、超聲時間3 min、超聲功率90 W、料液比1∶70、養(yǎng)晶溫度25℃、養(yǎng)晶時間3 h為結晶條件，經(jīng)過2次結晶豆甾醇的純度達到99.36%，實現(xiàn)了高純度豆甾醇的制備，經(jīng)質(zhì)譜、紅外光譜和核磁等結構鑒定確認富集精制工藝制得的樣品為豆甾醇。