缺氧對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21的調(diào)節(jié)作用

張學(xué)松　張謝　宋毓飛　林虹　吳玲劍

[摘要] 目的 觀察缺氧模擬物二氯化鈷（CoCl2）對(duì)人源HCT116腸癌細(xì)胞成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（FGF21）表達(dá)的影響。 方法 分別用0、50、100和200 μmol/L的CoCl2處理HCT116細(xì)胞24 h，同時(shí)用200 μmol/L的CoCl2處理HCT116細(xì)胞12、48 h，RT-PCR 法和Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞中的FGF21 mRNA和蛋白的表達(dá)水平;分別用缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑2ME2和YC-1，同時(shí)加入CoCl2處理HCT116腸癌細(xì)胞24 h，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中的FGF21 mRNA;用抗氧化劑NAC和CoCl2同時(shí)處理HCT116腸癌細(xì)胞24 h，RT-PCR法和Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞中的FGF21 mRNA和蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果 隨CoCl2濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，HCT116細(xì)胞FGF21 mRNA 相對(duì)表達(dá)量逐漸降低（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CoCl2組FGF21 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.05）。缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑處理后，HCT116細(xì)胞FGF21 mRNA相對(duì)表達(dá)量依然降低（P<0.05）。抗氧化劑處理后，HCT116細(xì)胞FGF21 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量未出現(xiàn)明顯降低（P>0.05）。 結(jié)論 CoCl2對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF21 的表達(dá)有抑制作用，該作用與缺氧誘導(dǎo)因子無(wú)關(guān)，而與氧化應(yīng)激有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 缺氧;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21;HCT116腸癌細(xì)胞;二氯化鈷

[中圖分類號(hào)] R735.3 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2019）25-0014-04

Regulation of hypoxia on fibroblast growth factor 21 in HCT116 intestinal cancer cells

ZHANG Xuesong1 ZHANG Xie2 SONG Yufei1 LIN Hong3 WU Lingjian4

1.Department of Gastroenterology，Ningbo Medical Center Lihuili Hospital，Ningbo ? 315040，China; 2.Department of Pharmacy，Ningbo Medical Center Lihuili Hospital，Ningbo ? 315040，China; 3.College of Laboratory Medicine，College of Life Sciences，Wenzhou Medical University，Wenzhou ? 325000，China; 4.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou ? 325000，China

[Abstract] Objective To observe the effect of hypoxia mimicking cobalt dichloride（CoCl2） on the expression of fibroblast growth factor 21（FGF21） in human HCT116 intestinal cancer cells. Methods HCT116 cells were treated with 0， 50， 100 and 200 μmol/L CoCl2 for 24 h， and HCT116 cells were treated with 200 μmol/L CoCl2 for 12 and 48 h. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of FGF21 mRNA and protein in the cells. HCT116 intestinal cancer cells were treated with hypoxia-inducible factor inhibitors 2ME2 and YC-1， respectively， added into CoCl2 for 24 h. RT-PCR was used to detect FGF21 mRNA in cells. HCT116 intestinal cancer cells were treated with antioxidants NAC and CoCl2 for 24 h， and the expression of FGF21 mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot. Results With the increase of CoCl2 concentration and prolonged action time， the relative expression of FGF21 mRNA in HCT116 cells decreased gradually（P<0.05）. Western blot results showed that the expression of FGF21 protein in CoCl2 group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）. After treatment with hypoxia-inducible factor inhibitor， the relative expression of FGF21 mRNA in HCT116 cells was still decreased（P<0.05）. After antioxidant treatment， the relative expression of FGF21 mRNA and protein in HCT116 cells did not decrease significantly（P>0.05）. Conclusion CoCl2 can inhibit the expression of FGF21 in HCT116 intestinal cancer cells， which is not related to hypoxia-inducible factors but related to oxidative stress.

[Key words] Hypoxia; Fibroblast growth factor 21; HCT116 intestinal cancer cells; Cobalt dichloride

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中缺氧及糖脂代謝紊亂是重要的病理生理過(guò)程，缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）對(duì)腫瘤細(xì)胞的能量代謝起重要的調(diào)控作用，但目前人們對(duì)缺氧導(dǎo)致腫瘤代謝紊亂的分子機(jī)制尚不完全清楚[1，2]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21（FGF21）是一種潛在的代謝調(diào)節(jié)因子，參與機(jī)體物質(zhì)代謝，維持機(jī)體內(nèi)脂糖代謝的平衡[3，4]。FGF21的主要功能體現(xiàn)在降低血糖和改善血脂方面[5]，但迄今為止，關(guān)于FGF21與腫瘤關(guān)系的研究報(bào)道甚少。本研究采用化學(xué)缺氧劑二氯化鈷（CoCl2）進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察缺氧對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF21表達(dá)的影響，為開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物提供新靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人源HCT116腸癌細(xì)胞（上海中科院細(xì)胞庫(kù)）;CoCl2，2ME2，YC-1，NAC（美國(guó)Sigma公司）;胎牛血清（FBS），Trizol，Mc Coy's 5A培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen公司），F(xiàn)GF21抗體（美國(guó)santa cruz公司，貨號(hào)：sc-81946）、GAPDH抗體（美國(guó)santa cruz公司，貨號(hào)：sc-47724）、兔抗鼠二抗（美國(guó)santa cruz公司，貨號(hào)：sc-2039）。

1.2 主要儀器

顯微鏡（ECLPSE 80i型，日本Nikon公司）;高速冷凍離心機(jī)（micro21R型，美國(guó)Thermo Fisher公司）;超純水（Direct-Q3 型，美國(guó)Millipore公司）;PCR儀（T100型，美國(guó)Bio-Rad公司）;凝膠成像儀器（ChemiDocTM XRS+，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116 腸癌細(xì)胞用含10% FBS的 Mc Coy's 5A的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。每48～72小時(shí)更換1次新鮮培養(yǎng)液，72～96 h傳代1次。

1.4 CoCl2對(duì)HCT116細(xì)胞的處理

3×105細(xì)胞/3 mL接種于100 mm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，0.1%血清培養(yǎng)基饑餓12 h后，分別用0、50、100和200 μmol/L 的CoCl2處理HCT116 細(xì)胞24 h后收取蛋白和RNA;用200 μmol/L 的CoCl2分別處理HCT116 細(xì)胞0、12和24 h，提取細(xì)胞總蛋白和RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑對(duì)HCT116細(xì)胞的處理

將HCT116細(xì)胞分為4 組，2ME2+CoCl2、YC-1+ CoCl2組分別以缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑2ME2（100 μmol/L）或YC-1（50 μmol /L）與CoCl2（200 μmol/L）同時(shí)處理HCT116細(xì)胞24 h，對(duì)照組不處理，CoCl2組直接加200 μmol/L的CoCl2處理24 h后提取細(xì)胞總蛋白和RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 抗氧化劑對(duì)HCT116細(xì)胞的處理

將HCT116細(xì)胞分為3 組，NAC+CoCl2組以ROS抑制劑NAC（3 μmol/L）與CoCl2（200 μmol/L）同時(shí)處理HCT116細(xì)胞24 h，對(duì)照組不處理，CoCl2組直接加200 μmol/L 的CoCl2處理24 h后提取細(xì)胞總蛋白和RNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 RT-PCR 法檢測(cè)FGF21 mRNA的表達(dá)

Trizol 法提取細(xì)胞中的RNA，取1 μg 的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)成cDNA 后進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin 為內(nèi)參照基因，上游引物為5′-GAGACCTTCAACACCCC-3′，下游引物為5′- ATAGCTCTTCTCCAGGGAGG -3′。mFGF21上游引物為5′-ACCTGGAGATCAGGGAGGAT-3′，下游引物為5′-GCACAGGAACCTGGATGTCT-3′。

1.8 Western bolt法檢測(cè)FGF21蛋白的表達(dá)

按蛋白裂解液說(shuō)明書(shū)抽提蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，蛋白變性后行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法到PVDF膜上，加入3% BSA封閉液，室溫下孵育2 h，加入FGF21一抗（1：500），4℃封閉過(guò)夜，棄一抗，Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫（TBST）洗3遍。加入1：5000的二抗，室溫孵育2 h后，棄二抗，TBST洗3遍，增強(qiáng)化學(xué)熒光發(fā)光法顯影，曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF21 mRNA表達(dá)的影響

0、50、100和200 μmol/L CoCl2作用于HCT116細(xì)胞24 h 后，F(xiàn)GF21 mRNA表達(dá)量分別為（0.99±0.24）μmol/L，（0.83±0.06）μmol/L，（0.45±0.07）μmol/L，（0.14±0.04）μmol/L，呈濃度梯度式下降，當(dāng)CoCl2濃度增加到100 μmol/L以后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1A;200 μmol/L CoCl2作用于HCT116細(xì)胞0、12和24 h后，F(xiàn)GF21 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.01±0.07）μmol/L，（0.44±0.16）μmol/L，（0.09±0.02）μmol/L，呈時(shí)間梯度式下降（P<0.05），見(jiàn)圖1B。故后續(xù)細(xì)胞采用200 μmol/L的CoCl2和24 h作為缺氧處理?xiàng)l件。

2.2 缺氧對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF21蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組（灰度值為1.04±0.17）相比，CoCl2處理組FGF-21 蛋白表達(dá)水平顯著下降（灰度值為0.54±0.15，P<0.05），表明化學(xué)缺氧可以顯著降低HCT116腸癌細(xì)胞內(nèi)FGF-21蛋白含量。

2.3 缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF21 mRNA表達(dá)的影響

用兩種不同的缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑2ME2和YC-1處理HCT116腸癌細(xì)胞，同時(shí)加入CoCl2處理 24 h。對(duì)照組、CoCl2組、2ME2+CoCl2組、YC-1CoCl2組FGF-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.05）μmol/L，（0.14±0.01）μmol/L，（0.12±0.03）μmol/L，（0.12±0.03）μmol/L。但是這兩種抑制劑并沒(méi)有緩解CoCl2對(duì)FGF-21 mRNA表達(dá)的抑制作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖3）。說(shuō)明CoCl2對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞中FGF-21表達(dá)的抑制作用并不依賴于缺氧誘導(dǎo)因子。

圖3 ? 缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF21 mRNA表達(dá)的影響 *P<0.05

2.4 氧化應(yīng)激對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF21表達(dá)的影響

為了研究CoCl2對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF-21的調(diào)節(jié)作用是否與氧化應(yīng)激有關(guān)，抗氧化劑NAC與CoCl2同時(shí)處理HCT116腸癌細(xì)胞24 h。對(duì)照組、CoCl2組、NAC+CoCl2組mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.01±0.14）μmol/L，（0.45±0.09）μmol/L，（0.72±0.07）μmol/L。對(duì)照組、CoCl2組、NAC+CoCl2組灰度值分別為（1.00±0.02），（0.41±0.03），（0.58±0.04）。如圖4A、B所示，CoCl2對(duì)HCT116細(xì)胞FGF-21mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào)作用被NAC抑制，說(shuō)明CoCl2對(duì)HCT116細(xì)胞FGF-21的調(diào)節(jié)作用依賴于氧化應(yīng)激。

圖4 ? NAC對(duì)HCT116腸癌細(xì)胞FGF21表達(dá)的影響

（A：NAC與CoCl2同時(shí)處理24 h HCT116腸癌細(xì)胞FGF21 mRNA的表達(dá)情況;B：NAC與CoCl2同時(shí)處理24 h HCT116腸癌細(xì)胞FGF21蛋白的表達(dá)情況;C：FGF21與GAPDH灰度比值，*P<0.05）

3 討論

腫瘤最主要的特征是腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)失控，不斷增多的細(xì)胞導(dǎo)致耗氧量增加，從而形成腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境，這在機(jī)體實(shí)體瘤中的表現(xiàn)尤其明顯[6，7]。缺氧可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括誘發(fā)酸性內(nèi)環(huán)境、觸發(fā)腫瘤微血管形成、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)腫瘤免疫逃避和腫瘤適應(yīng)、維持腫瘤干細(xì)胞的存在及抑制衰老[8-10]。HIF-1是在缺氧條件下存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，它最先在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)[11]。作為轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1可調(diào)控多種與腫瘤相關(guān)的基因，這些基因表達(dá)的蛋白有利于腫瘤在缺氧條件下的能量代謝和氧氣輸送[11-13]。目前研究顯示腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中缺氧及糖脂代謝紊亂是重要的病理生理過(guò)程，但人們對(duì)缺氧導(dǎo)致腫瘤代謝紊亂的分子機(jī)制尚不完全清楚。

FGF21是FGFs的一個(gè)新成員，與以前發(fā)現(xiàn)的FGFs不同，它與糖脂代謝有著密切的關(guān)系，具有內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能[14，15]。在肥胖嚙齒類動(dòng)物中，F(xiàn)GF21能夠減輕其體重，增加胰島素敏感性以及調(diào)節(jié)脂蛋白水平[15]。本文前期研究發(fā)現(xiàn)CoCl2誘發(fā)急性化學(xué)缺氧可加重非酒精脂肪肝小鼠的肝臟損傷，并上調(diào)FGF21的表達(dá)[16]，但FGF21與腫瘤相關(guān)性研究甚少。本研究還發(fā)現(xiàn)脂肪肉瘤組織中FGF21蛋白較瘤旁組織中表達(dá)率明顯降低，隨訪結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21蛋白高表達(dá)組患者較低表達(dá)組預(yù)后更好，不易發(fā)生復(fù)發(fā)[17]。在肝臟組織中，肝細(xì)胞特異性FGF21的過(guò)表達(dá)可以延緩化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的肝癌形成，而不影響正常肝臟發(fā)育及損傷后的代償性反應(yīng)[17]。過(guò)表達(dá)的FGF21可能是通過(guò)激活肝細(xì)胞上的FGF受體（FGFR4）來(lái)延緩二乙基亞硝胺誘導(dǎo)肝癌的進(jìn)程[19]。在腫瘤細(xì)胞中，缺氧對(duì)FGF21的調(diào)控似乎與細(xì)胞類型有關(guān)。在鼠黑色素瘤細(xì)胞中，缺氧可以誘導(dǎo)FGF21的表達(dá);但在腸道的腫瘤細(xì)胞中，缺氧卻可以抑制FGF21的主要轉(zhuǎn)錄因子PPAR-α的表達(dá)[20]。化學(xué)缺氧對(duì)Caco-2細(xì)胞中FGF21的影響不依賴于HIF-α，而是依賴于氧化應(yīng)激介導(dǎo)的機(jī)制[21]。這些研究均表明，缺氧導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的代謝紊亂可能與FGF21有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)缺氧降低HCT116腸癌細(xì)胞FGF21 mRNA和蛋白的表達(dá)量，且FGF21的調(diào)控作用與缺氧誘導(dǎo)因子無(wú)關(guān)，依賴于氧化應(yīng)激反應(yīng)。接下來(lái)將進(jìn)一步研究FGF21對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝的調(diào)控作用，闡明FGF21的生物學(xué)功能，為腫瘤防治和新藥開(kāi)發(fā)提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-03-04）