不同產(chǎn)地菜籽油的HPLC-DAD指紋圖譜建立

華姝雯，王 磊，饒桂維*

(1.浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015;2.杭州師范大學(xué) 錢江學(xué)院理工分院，浙江 杭州 310018)

油菜花(Brassica campestris)是十字花科薹屬植物，主要集中在長江流域，其籽粒是浸制油脂原料主要品種之一[1]。近年來我國的種植面積已超過900萬hm2，產(chǎn)量占全國油料總產(chǎn)量的30%以上，居世界首位[2]。菜籽油是世界第二大油料作物，同時也是重要的生物柴油來源之一[3-4]。

菜籽多酚是油菜籽獨(dú)有的具有氧化活性的，有抗腫瘤、降血糖、抑菌、清除自由基作用的一類重要次級代謝產(chǎn)物[5]。我國主要將其加工為菜籽油,因此菜籽油富含菜籽多酚等多種功能活性成分[6]，被評為“最健康的食用植物油之一”[7]。但隨著工業(yè)化的發(fā)展，土壤中的重金屬含量日益增加，由于各地區(qū)的工業(yè)化程度不同，其土質(zhì)不同，因此如何有效的鑒定菜籽油的食品安全具有重大意義。不同區(qū)域的油菜品種，油菜籽的干燥方法和其榨油機(jī)械、加工過程和油脂精煉存在較大差異，因此菜籽油中菜籽多酚含量、磷脂含量以及產(chǎn)品品質(zhì)有很大的不同[8-12]。且不同產(chǎn)地的油菜籽氨基酸組成和總酚含量也不同[5，13]。

由于HPLC具有分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，HPLC指紋圖譜法已成為中藥指紋圖譜技術(shù)的首選方法[14-15]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對18種不同產(chǎn)地的菜籽油進(jìn)行指紋圖譜研究，為不同地區(qū)菜籽油的初步鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：選取浙江、上海、蘇州、安徽等地區(qū)出產(chǎn)的菜籽油，其樣品編號和來源地見表1。

表1 供試菜籽油的產(chǎn)地及編號Tab.e 1 habitats and number of experimental rapeseed oil

試劑：乙腈(色譜純)：TEDIA，美國、甲醇(分析純)：永華化學(xué)科技、磷酸(分析純)：永華化學(xué)科技，使用水為超純水。所用溶液使用前均用0.22 μm濾膜過濾。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀(配有DAD檢測器)Agilent 110系列：Agilent公司，美國；超低有機(jī)物型純水系統(tǒng)Milli-Q：Millipore公司，美國；高速離心機(jī)LG10-2.4A：北京時代北利離心機(jī)有限公司；紫外分光光度計(jì)L6S：上海精科；電子天平PL402-L：梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲波清洗器JK-100：合肥金尼機(jī)械制造有限公司；玻璃儀器快速烘干器C型30：長城科工貿(mào)有限公司；漩渦混合器XW-80A:寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 菜籽油提取方法

準(zhǔn)確稱取油樣品5 g(精確至0.0001)，置于50 mL離心管中，加入8 mL甲醇(提取溶劑)。旋渦混合3 min，放置2 min，以3000r/min離心5 min，取出上清液于25 mL容量瓶中，殘余物每次用8 mL甲醇提取兩次。三次的清液均合并于25 mL容量瓶中，并用甲醇定容，搖勻，得到樣品溶液，再將溶液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，得到樣品供試液。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

1.4.1 提取溶劑

按1.3節(jié)方法將其中的提取溶劑改為：甲醇、乙醇、乙腈。不同的溶劑提取各平行三次，通過色譜分析，將數(shù)據(jù)取平均值，以確定最佳提取溶劑。

1.4.2 色譜分析的波長

將18個樣品按1.3節(jié)制備得到樣品供試溶液，分別用移液槍移取500μL該溶液于10 ml容量瓶中，并用甲醇定容至刻度。將樣品溶液分別置于比色皿中，利用紫外可見分光光度計(jì)掃描樣品供試溶液，掃描波長范圍為200 nm-300 nm，每個樣品各掃描1次。

1.4.3 色譜流動相

為了確定好的分離條件，選擇甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相，分別對樣品供試液進(jìn)行色譜分析，選擇分離效果最好的為實(shí)驗(yàn)的流動相。

1.4.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18(4.6 ×250 mm，5μm)，流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。流動相：A相和B有機(jī)相；洗脫程序：0～10 min，10%～30%B；10～20 min， 30%～60%B；20～30 min，60%～90%B；30～40 min，90%B。 通過波長和流動相的確定，根據(jù)出峰情況需調(diào)整洗脫程序時間和流動相比例。

1.5 方法學(xué)考查

1.5.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取S18樣品供試液，按1.4.4所提出的色譜條件，分別選擇在0、3、6、9、12、15h進(jìn)樣，將峰值最突出的三個色譜峰為參照峰，計(jì)算各自的保留時間和峰面積的RSD值[16]。

1.5.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取S18樣品供試液，按1.4.4所提出的色譜條件，連續(xù)6次進(jìn)樣，將峰值最突出的三個色譜峰為參照峰，記錄他們的保留時間和峰面積，計(jì)算各自的RSD值[16]。

1.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按1.3節(jié)平行制備6份S18供試樣品溶液，按1.4.4所提出的色譜條件，連續(xù)6次進(jìn)樣，將峰值最突出的三個色譜峰為參照峰，記錄并計(jì)算各自的相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差[16]。

1.6 樣品的測定

取18個樣品，按1.3節(jié)的方法制備得到供試樣品溶液，在1.4.4節(jié)的色譜條件下進(jìn)行檢測，采集18個油樣品在45 min內(nèi)的色譜圖。

1.7 指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理

1.7.1 相似度分析

分別將18個供試樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004年A版)》，采用多點(diǎn)校正后匹配，建立18個不同產(chǎn)地菜籽油的指紋圖譜，以生成的特征指紋圖譜共有模式為對照，計(jì)算得出各地區(qū)油樣品的相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.1.1 提取溶劑

用乙醇、甲醇、乙腈3個有機(jī)溶劑提取菜籽油樣品，分別得到3個色譜圖，根據(jù)譜圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以采用甲醇提取的色譜峰數(shù)目最多，分離效果較好，所以實(shí)驗(yàn)采用甲醇作為提取溶劑提取菜籽油樣品。

2.1.2 色譜分析的波長

由圖1可知，樣品溶液在紫外波長為210 nm、270 nm和280 nm處吸收峰較高。由于210 nm處波長較短，溶劑效應(yīng)較強(qiáng)，故排除210 nm為最佳吸收波長。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)測得270 nm和280 nm波長下的圖譜發(fā)現(xiàn)，波長為280 nm時的色譜峰數(shù)目比270 nm多，所以實(shí)驗(yàn)選擇280 nm為色譜分析波長。

圖1 樣品紫外光譜掃描圖Fig.1 UV spectrogram of sample

2.1.3 流動相的確定

分別用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相對S18樣品供試液進(jìn)行色譜分析實(shí)驗(yàn)，通過對這四個譜圖比較發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相的各峰分離效果較好，色譜峰形較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為實(shí)驗(yàn)的流動相。

2.1.4 洗脫程序的優(yōu)化和色譜條件的確定

色譜柱：Hypersil ODS C18(4.6 ×250 mm，5μm)，流動相：0.1%磷酸溶液(A)和乙腈(B)；經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)得出較為理想的梯度洗脫條件：0～15 min，10%～18%B；15～16 min，18%～30%B；16～26 min，30%B；26～31 min，30%～60%B；31～36 min，60%～90%B；36～40 min，90%B；40～45 min，90%～10%B，流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 菜籽油指紋圖譜的建立

2.2.1 指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

將18個油樣品色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004年A版)》軟件里，對樣品圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，設(shè)置S18為參照指紋圖譜，時間窗寬度設(shè)為0.3 min，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行匹配，建立18種菜籽油的HPLC指紋圖譜共有模式(平均值法)，根據(jù)匹配結(jié)果確定23個共有峰(圖2)， 并生成對照指紋圖譜(圖3)。

計(jì)算出各批次樣品的指紋圖譜相似度。根據(jù)相似度分析結(jié)果(表2)，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S14、S16、S17樣品相似度大于0.8；而S9、S13、S15、S18樣品相似度較低，與其他樣品相差較大。

圖2 18個樣品的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 18 samples

圖3 菜籽油的對照指紋圖譜Fig.3 rapeseed oil contrast fingerprints

表2 18種菜籽油相似度評價(jià)結(jié)果Tab.e 2 Similarity evaluation results of 18 kinds of rapeseed oil

2.2.2 指紋圖譜中共有峰指認(rèn)

對標(biāo)準(zhǔn)維生素E樣品進(jìn)行高效液相測定(圖4)，根據(jù)出峰時間順序，確認(rèn)1 2 3號峰分別為α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚。根據(jù)相對保留時間，并對照共有峰的保留時間，指認(rèn)了指紋圖譜23個共有峰中的α-生育酚(13號峰)、β-生育酚(19號峰)、γ-生育酚(22號峰)。19號峰β-生育酚峰形好，峰面積圖譜中所占比例較大且穩(wěn)定，并為18個樣品所共有，相較于13號峰，19號峰與相鄰色譜峰的分離度良好，易于識別，故選其為特征圖譜的參照峰。以β-生育酚峰為參照峰，計(jì)算23個共有峰相對峰面積，結(jié)果見表3。由表中結(jié)果可看出統(tǒng)一保留時間共有峰相對峰面積的RSD值相差很大，說明不同地區(qū)因地理環(huán)境，種質(zhì)資源等外界因素對菜籽油化學(xué)成分含量有一定差異，導(dǎo)致其質(zhì)量存在差異。

1.α-生育酚；2.β-生育酚；3.γ-生育酚；1.α- Tocopherol 2.β- Tocopherol；3.γ- Tocopherol

圖4 維生素E的對照圖譜

Fig.4 Vitamin E contrast fingerprints

表3 共有峰的相對峰面積Tab.e 3 relative peak area of the common peak

表3(續(xù))

2.4 方法學(xué)評價(jià)

2.4.1 穩(wěn)定性

取S18樣品供試液，在2.1.4色譜條件下分別在0、3、6、9、12、15h下進(jìn)樣，以13(α-生育酚峰)、19(β-生育酚峰)、22(γ-生育酚峰)為參照峰，記錄各相對峰面積和相對保留時間，結(jié)果見表4。計(jì)算得出峰面積的平均RSD為2.18，保留時間的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53，無論是個體或平均RSD均小于3，結(jié)果表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.e 4 stability test results

2.4.2 精密度

取S18樣品供試液，按2.1.4節(jié)的色譜條件，連續(xù)6次進(jìn)樣，以13(α-生育酚峰)、19(β-生育酚峰)、22(γ-生育酚峰)為參照峰，記錄各峰的相對保留時間、相對峰面積，結(jié)果見表5。計(jì)算得出峰面積的平均RSD為0.91，保留時間的平均RSD為0.31，無論是個體或平均RSD均小于3，結(jié)果表明該方法具有良好的精密度與準(zhǔn)確度。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.e 5 precision test results

2.4.3 重復(fù)性

將樣品S18按1.3節(jié)平行制備供試樣品溶液6份，按2.1.4節(jié)的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以13(α-生育酚峰)、19(β-生育酚峰)、22(γ-生育酚峰)為參照峰，記錄各峰的相對保留時間、相對峰面積，結(jié)果見表6。計(jì)算得出峰面積的平均RSD為1.12，保留時間的平均RSD為0.52，無論是個體或平均RSD均小于3，結(jié)果表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.e 6 repeatability test results

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過HPLC-DAD法測得18個不同產(chǎn)地菜籽油的色譜圖，并摸索出最適合菜籽油指紋圖譜建立的色譜條件：以乙腈和0.1%磷酸為流動相，洗脫梯度為0～15 min，10%～18%B；15～16 min，18%～30%B；16～26 min，30%B；26～31 min，30%～60%B；31～36 min，60%～90%B；36～40 min，90%B；40～45 min，90%～10%B，色譜分析波長為280 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為10μL。在《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004年A版)》建立18個不同產(chǎn)地菜籽油HPLC-DAD指紋圖譜，以S18為對照指紋圖譜計(jì)算出18個油樣品的相似度，結(jié)果得出除S9、S13、S15、S18(鹽城大豐、上海靜安、溫州樂清、寧波慈溪)外，其他油樣品的相似度均大于0.8；并標(biāo)示出23個共有峰，三個已確認(rèn)成分，分別為α-生育酚(13號峰)、β-生育酚(19號峰)、γ-生育酚(22號峰)。本實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性好，具有一定的專屬性，為不同地區(qū)菜籽油的初步鑒別質(zhì)量評價(jià)提供了參考。