近紅外熒光探針檢測(cè)堿性磷酸酶的研究進(jìn)展

齊亞軍，姜良勇，王洪香，殷儷寧，高榮升*

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007； 2.德州市中醫(yī)院，山東 德州 253000)

惡性腫瘤已成為威脅人類生命健康的主要疾病之一[1]，在我國(guó)這種情況更為嚴(yán)重，能否盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤和介入治療對(duì)患者生存期的延長(zhǎng)起到了重要作用[2]。臨床研究表明惡性腫瘤在發(fā)病初期臨床癥狀并不明顯，易被患者忽視，當(dāng)腫瘤發(fā)展至中晚期時(shí)，發(fā)生擴(kuò)散或產(chǎn)生明顯包塊臨床癥狀才凸顯出來，此時(shí)再進(jìn)行手術(shù)治療往往伴隨著高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率，而該階段腫瘤已對(duì)傳統(tǒng)的放射療法和化學(xué)藥物療法不再敏感，最終給患者帶來極大的痛苦。早期惡性腫瘤可以通過外科手術(shù)進(jìn)行切除，這也是早期患癌病人的最有效和首選的治療方案。然而，實(shí)體腫瘤的切除往往需要富有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生負(fù)責(zé)完成，其往往需要腫瘤的體積達(dá)到一定大或出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移灶才能確診。因此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)急需一種能夠幫助臨床醫(yī)生快速診斷腫瘤存在和明確腫瘤大小及邊界的檢測(cè)手段，這也是廣大科研工作者急需突破的診斷技術(shù)瓶頸。

近年來研究發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化常導(dǎo)致酶合成異常。由于酶促變化發(fā)生在形態(tài)變化之前，因此癌前病變中酶的血清活性的研究受到高度重視。堿性磷酸酶(ALP)是一種水解酶，可催化蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)底物的水解和轉(zhuǎn)磷酸化，由一組在哺乳動(dòng)物組織中廣泛存在的同工酶組成[3]。越來越多的證據(jù)表明血液中ALP水平異常升高與癌癥，心臟病，骨骼疾病和肝臟疾病等各種疾病有關(guān)[4-5]。因此，開發(fā)一種操作簡(jiǎn)單、迅速高效、靈敏度高、特異性好的ALP檢測(cè)方法對(duì)人類疾病的臨床診斷具有重要的意義[6]。

1 ALP檢測(cè)方法

1.1 電化學(xué)檢測(cè)法

依據(jù)電能與化學(xué)能之間相互轉(zhuǎn)變的原理，ALP能夠水解多種多樣的磷酸單酯為可檢測(cè)的酚衍生物，使用非電性基底進(jìn)行電化學(xué)，在ALP作用后去磷酸化產(chǎn)生電活性產(chǎn)物。如對(duì)氨基苯基磷酸酯(PAPP)已被廣泛用作基板，堿性磷酸酶脫磷產(chǎn)生對(duì)氨基苯酚(PAP)，可以在低電位下測(cè)量電流[7]，從而得知堿性磷酸酶的含量。電化學(xué)檢測(cè)法具有靈敏度高、周期短、成本低、和廣泛的基體物種性等優(yōu)點(diǎn)。但其穩(wěn)定性受限，易受背景信號(hào)的影響，可重復(fù)性較低。

1.2 化學(xué)發(fā)光法

堿性磷酸酶水解AMPPD(1,2-二氧環(huán)己烷衍生物)生成可以被強(qiáng)光分解的苯氧化物中間態(tài)，通過檢測(cè)其被光分解后的活度來確定酶活性大小。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高，但該底物藥品價(jià)格昂貴[8]。

1.3 納米探針檢測(cè)法

將金納米粒子與過載的羥基磷灰石結(jié)合，再與用于醫(yī)療診斷的成像染料如吲哚菁綠偶聯(lián)構(gòu)成智能納米探針，堿性磷酸酶水解的磷酸基團(tuán)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)被檢測(cè)出，其含量通過熒光強(qiáng)弱來判斷。該方法通過非侵入的方式檢測(cè)體內(nèi)或體外的ALP含量，具有自發(fā)熒光干擾小、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。但其特異性較差且熒光染料的不同限制了其靈敏度[9]。

1.4 熒光探針檢測(cè)法

磷酸酯為堿性磷酸酶的作用底物，設(shè)計(jì)含有具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射特性的熒光素與磷酸酯的熒光探針，利用分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的原理，達(dá)到磷酸化與去磷酸化的即時(shí)轉(zhuǎn)換，可觀測(cè)到磷酸化時(shí)為低熒光狀態(tài)，去磷酸化時(shí)表現(xiàn)為強(qiáng)熒光狀態(tài)，根據(jù)熒光的強(qiáng)弱以達(dá)到檢測(cè)ALP的目的[10]。

Park Sung Young 教授課題組在2017年報(bào)道了一種能夠根據(jù)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性用于腫瘤的特異性熒光傳感的熒光淬滅型探針C-FNP[11]。當(dāng)堿性磷酸酶作用于該探針時(shí)，磷酸根從4-硝基苯磷酸鹽上解離，成為 4- 硝基苯酚，根據(jù)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移原理電子被轉(zhuǎn)移到 4-硝基苯酚，熒光發(fā)生猝滅，以此實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)的腫瘤成像。其檢測(cè)原理如圖1所示。

Fig.1 The principle of C-FNP detecting ALP

2017 年，譚蔚泓教授課題組設(shè)計(jì)合成了一種完全不溶于水且固態(tài)時(shí)發(fā)射強(qiáng)熒光的基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移 ( Excited State Intramolecular Proton Transfer,ESIPT)的新型固態(tài)熒光團(tuán)HTPQ[12]。作者進(jìn)一步將 HTPQ 設(shè)計(jì)為堿性磷酸酶的響應(yīng)熒光探針 HTPQA。HTPQA 能夠在活體細(xì)胞中原位檢測(cè)內(nèi)源性的 ALP，達(dá)到腫瘤組織可視化的目的。其檢測(cè)原理如圖2所示。

Fig.2 The principle of HTPQA detection of ALP

商化染料ELF-97是可溶性的磷酸酶底物，其ALP作用位點(diǎn)磷酸基團(tuán)移除時(shí)可由只在藍(lán)色范圍有弱熒光的狀態(tài)生成強(qiáng)烈熒光的黃綠色沉淀，斯托克位移超過了100nm。其檢測(cè)原理如圖3所示。

Fig.3 The principle of ELF-97 detecting ALP

2018年，張志琪教授課題組將熒光硅納米粒子(SINPs)作為熒光探針，建立了一種簡(jiǎn)單靈敏 、選擇性高的堿性磷酸酶活性檢測(cè)方法[13]。堿性磷酸酶催化對(duì)硝基苯磷酸二鈉( Disodium Nitrophenyl Phosphate,PNPP)水解產(chǎn)生吸收光譜與熒光硅納米粒子的激發(fā)光譜有很好的重疊的對(duì)硝基酚(P-Nitrophenol,PNP)，從而猝滅SINPs的熒光。通過監(jiān)測(cè)SINPs的熒光猝滅率與對(duì)硝基酚含量之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)對(duì)ALP活性的測(cè)定。其檢測(cè)原理如圖4所示。

Fig.4 The principles of SINPs for detecting ALP

熒光探針檢測(cè)法為非入侵性、傳感機(jī)制簡(jiǎn)單，操作方法簡(jiǎn)便，但受到熒光染料的影響，導(dǎo)致其特異性差、不能準(zhǔn)確識(shí)別，毒性以及存在背景干擾等。傳統(tǒng)的熒光染料存在靈敏度低、特異性差、復(fù)雜的傳感機(jī)制以及短的發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)等弊端，相比傳統(tǒng)的熒光染料，近紅外熒光染料有更長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)、極好的時(shí)空分辨率、更深的組織穿透力以及較低的自發(fā)熒光的背景干擾，可以更加完善的檢測(cè)體內(nèi)堿性磷酸酶的活性。

2 近紅外熒光探針檢測(cè)ALP的研究進(jìn)展

NIR熒光探針改變了傳統(tǒng)熒光染料的低靈敏度及低特異性，對(duì)生物基質(zhì)的破壞作用小于紫外和可見熒光團(tuán)的影響。目前，適宜合成檢測(cè)堿性磷酸酶的NIR熒光探針主要有：

2.1 香豆素類近紅外熒光探針

常規(guī)的香豆素類熒光探針因其發(fā)射波長(zhǎng)較短，主要在400～520nm區(qū)域，組織穿透性弱、易受到背景熒光干擾的特性限制了其在活體成像中的應(yīng)用，但因其具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性、較高的熒光量子產(chǎn)率、易于修飾的特性，近年來香豆素類熒光染料的結(jié)構(gòu)修飾成為研究熱點(diǎn)[14]。如將半花菁結(jié)構(gòu)引入到香豆素、將香豆素并入BODIPY中，合成了一系列新型NIR熒光染料。改良修飾后的香豆素?zé)晒馓结樤诒Ａ粼械腟tokes 位移大、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，使香豆素的吸收和發(fā)射光譜顯著向 NIR 區(qū)域移動(dòng)，這一優(yōu)化使其更加廣泛的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如檢測(cè)各種離子、熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)分子等，有望成為檢測(cè)ALP的新型近紅外熒光探針。2018年江洪教授課題組報(bào)道了一類檢測(cè)ALP的香豆素?zé)晒馓结榌15]，其原理為堿性磷酸酶水解抗壞血酸磷酸酯鈉產(chǎn)生可將二價(jià)銅離子還原成為一價(jià)亞銅離子的游離態(tài)抗壞血酸鈉，通過催化反應(yīng)和疊氮反應(yīng)使弱熒光強(qiáng)度的4-甲基-7-乙炔基香豆素生成強(qiáng)熒光強(qiáng)度的三氮唑香豆素，通過熒光增強(qiáng)的程度檢測(cè)ALP的活性。其檢測(cè)原理如圖5所示。

Fig.5 The principle of detection of ALP by coumarin probe

2.2 花菁染料熒光探針

花菁染料熒光探針具有較高的吸光系數(shù)，是已知的最早可發(fā)射紅外和近紅外波長(zhǎng)的染料。花菁染料具有吸光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)均在近紅外區(qū)等優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)，這使得花菁染料作為熒光探針具有較高的檢測(cè)靈敏度、對(duì)組織損傷較小、不受生物組織干擾等優(yōu)點(diǎn)。因此，花菁染料被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)療診斷[16]。2019年，吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院課題組設(shè)計(jì)了一種新型半花菁熒光染料MTR用于檢測(cè)堿性磷酸酶的活性[17]。在ALP存在下，該熒光團(tuán)在723nm處表達(dá)56倍的熒光增強(qiáng)。與經(jīng)典的花菁染料相比，它具有更長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)，更大的斯托克斯位移和更高的量子產(chǎn)率，該探針已成功實(shí)現(xiàn)了在不同細(xì)胞中對(duì)堿性磷酸酶的熒光成像檢測(cè)。其檢測(cè)原理如圖6所示。黃鵬教授等人在2019年將近紅外熒光(NIRF)成像與光聲(PA)成像相結(jié)合用于ALP的檢測(cè)[18]。該探針由近紅外熒光團(tuán)LET-CyOH和磷酸鹽組成，可在730nm處顯示出23倍的NIRF增強(qiáng)，激活時(shí)在710nm處顯示出27倍的PA增強(qiáng)。該成果利用光聲成像克服了近紅外熒光成像的低空間分辨率和穿透深度限制的弊端，對(duì)ALP具有較高的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)對(duì)堿性磷酸酶高空間分辨率的檢測(cè)，其檢測(cè)原理如圖7所示。2017年，Tan Y[19]等人使用花菁DHX作為近紅外熒光團(tuán)，磷酸基團(tuán)作為反應(yīng)位點(diǎn)，該探針有著較高的吸光系數(shù)，較強(qiáng)的靈敏度以及較低的細(xì)胞毒性，在細(xì)胞和活體水平實(shí)現(xiàn)了對(duì)堿性磷酸酶的檢測(cè)。其檢測(cè)原理如圖8所示。同年，李春艷課題組設(shè)計(jì)合成了一種基于半花菁的NIR熒光探針CyP用于檢測(cè)堿性磷酸酶[20]。堿性磷酸酶能夠催化CyP中磷酸基的斷裂，誘導(dǎo)CyP 向 CyOH 轉(zhuǎn)化，在738 nm處發(fā)射熒光。該熒光探針的最大發(fā)射峰位于近紅外區(qū)域，組織穿透性強(qiáng)，已應(yīng)用于活體細(xì)胞、組織和小鼠內(nèi)源性ALP的檢測(cè)和成像，該探針具有較高的靈敏度及較低的ALP檢測(cè)線。其檢測(cè)原理如圖9所示。

Fig.6 The principle of MTR detection of ALP

Fig.7 The principle of LET-CYOH detection of ALP

Fig.8 The principle of DHXP detecting ALP

Fig.9 The principle of Cy-OH detection of ALP

2.3 BODIPA類熒光探針

BODIPA是一種氟硼二吡咯類化合物，具有良好的物理化學(xué)性質(zhì)，如對(duì)酸堿不敏感、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、熒光量子產(chǎn)率較高(在水中通?？蛇_(dá)到 100%)、熒光激發(fā)和發(fā)射峰寬較窄、吸收和發(fā)射峰波長(zhǎng)通?？蛇_(dá)到可見光區(qū)甚至近紅外區(qū)、在很多有機(jī)溶劑中溶解度都較高等，可以廣泛應(yīng)用于生物檢測(cè)[21]。Lin[22]等人于2016年報(bào)道了以BODIPY衍生物作為熒光基團(tuán)、可以被ALP水解形成BODIPY 腺苷染料和磷酸根離子的三磷酸腺苷作為識(shí)別位點(diǎn)的熒光探針，通過BODIPY腺苷染料的熒光強(qiáng)度檢測(cè)ALP的活性。其檢測(cè)原理如圖10所示。

Fig.10 The principle of detection of ALP by BODIPY probes

2.4 熒光素類熒光探針

熒光素類探針因具有較高的熒光量子產(chǎn)率、較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度、良好的水溶性、其衍生物的最大發(fā)射波長(zhǎng)可以達(dá)到紅外甚至近紅外區(qū)域的特點(diǎn)近年來受到廣大科研人員的追捧。但其也存在一定的缺陷，如光穩(wěn)定性差、該類探針的合成收率較低，且提純困難。盡管如此，由于其具有較大的stokes位移、細(xì)胞滲透性強(qiáng)、線粒體靶向定位等優(yōu)勢(shì)，使得該類探針被廣泛用于化學(xué)、生化、生物以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[23-24]。以熒光素作為發(fā)光基團(tuán)的熒光素二磷酸酯(3,6-fluorescein diphosphate,FDP)，作為ALP的作用底物具有較強(qiáng)的靈敏度。因其較高的熒光量子產(chǎn)率、較低的檢測(cè)線、良好的光穩(wěn)定性使得 FDP 成為一個(gè)優(yōu)越的堿性磷酸酶底物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。其檢測(cè)原理如圖11所示。

Fig.11 The principle of FDP detection of ALP

3 作用機(jī)制

近紅外熒光診斷試劑由熒光團(tuán)和磷酸酶反應(yīng)位點(diǎn)組成，采用OFF-ON型策略設(shè)計(jì)，基本原理為分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移。診斷試劑在OFF狀態(tài)，此時(shí)熒光基團(tuán)處于缺電子狀態(tài)，整個(gè)體系為不發(fā)熒光狀態(tài)。當(dāng)該體系在體內(nèi)弱堿性環(huán)境下通過堿性磷酸酶的酶促去磷酸化后，磷酸酶去除熒光基團(tuán)上的磷酸部分，導(dǎo)致分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)的恢復(fù)和熒光的"開啟"成為ON的狀態(tài)，此時(shí)熒光基團(tuán)處于給電子狀態(tài)，該試劑可以發(fā)射激發(fā)光處在600nm以上的近紅外紅光，并可以被熒光光譜儀檢測(cè)到，以達(dá)到體內(nèi)堿性磷酸酶活性可視化的目的。

4 展望

本文綜述了近年來幾種常見的熒光探針及近紅外熒光探針在堿性磷酸酶領(lǐng)域的應(yīng)用，這些熒光染料具有良好的性質(zhì)，但因其光穩(wěn)定性差、選擇性低等缺陷仍需要構(gòu)建更加穩(wěn)定、光毒性低、組織穿透力更強(qiáng)的近紅外熒光探針，進(jìn)而應(yīng)用于癌癥的早期診斷、癌組織切除手術(shù)及抗癌化合物代謝篩選等方面，使癌組織達(dá)到可視化的目的。