五因素混水平正交實驗優(yōu)化魚鱗膠原提取工藝

李澤民，何生林，丁云橋，楊成功，王榮浩，張崢，劉洪博

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 化學與制藥工程學院,山東 濟南 250353)

膠原是細胞外基質(zhì)(ECM)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。它的基本結(jié)構(gòu)是由3條分子質(zhì)量約為95KDa的肽鏈，以三股螺旋方式相互纏繞而形成的分子質(zhì)量約為300KDa的巨型蛋白質(zhì)分子，大約有1000個氨基酸。膠原分子間相互聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成富有彈性的組織構(gòu)造[1]。膠原結(jié)構(gòu)的有序性、取向性、功能性和可控性及其良好的生物活性、生物相容性，可降解，無毒，不引起異體免疫反應等優(yōu)良性能，使其在化妝品、生物基新材料、醫(yī)學和食品等行業(yè)有廣泛的應用和市場前景[2-4]。

目前的膠原蛋白常來源于哺乳動物皮肌腱、骨骼等?？紤]到瘋牛病、口蹄疫等不安全因素的存在，一些發(fā)達國家目前正禁止從哺乳動物皮中提取膠原蛋白，他們積極尋找安全的膠原蛋白來源。魚鱗中的膠原蛋白的純度較高，來源廣，價格低廉，生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生等，作為膠原蛋白的提取來源，有很高經(jīng)濟價值[5]。對魚源膠原提取的工作，國內(nèi)外有不少報道[6-7]。王哲平等研究表明，在40℃條件下，刺參膠原蛋白不僅三級螺旋結(jié)構(gòu)打開，二級結(jié)構(gòu)被破壞，一級結(jié)構(gòu)也已經(jīng)發(fā)生了變化，α鏈和β鏈發(fā)生降解，形成不同分子量的多肽鏈[8]。劉文濤等在黑魚魚鱗的結(jié)構(gòu)中用透射電鏡表明了魚鱗中膠原纖維成正交式夾板結(jié)構(gòu)分布，這個結(jié)果對以后提取魚鱗中的膠原蛋白有一定的參考意義[9]。目前，常用的魚鱗膠原提取方法有：酸法、堿法、鹽法、酶法等。由于膠原分子在水中的溶解度較低。有一部分未能共價交聯(lián)或者體內(nèi)未成熟的膠原可用中性鹽或稀酸溶液溶解而提取出來[1]。張俊杰等進行了鯉魚酸溶性膠原蛋白提取的研究，發(fā)現(xiàn)脫鈣前用堿處理魚鱗，會提高提取率，并且膠原蛋白的提取率與溫度成正比[10]。涂燦時等在對膠原蛋白提取用正交實驗的方法發(fā)現(xiàn)在酸提取中，檸檬酸的提取率最高[11]。

膠原的酸法提取成本低，提取后的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且提取過程中不生成有害物質(zhì)。但是，相對于酶法等，酸法提取率較低。為了保證提取純度，得到更高的膠原提取率，本試驗采用草魚魚鱗等作為原料，使用酸法提取魚鱗膠原。通過五因素混水平正交實驗設(shè)計，進行提取工藝的優(yōu)化，對提取的膠原蛋白進行結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的分析與表征。我國淡水魚產(chǎn)量豐富[12]，但是淡水魚的加工僅局限于對魚肉的利用，對魚鱗等下腳料的利用較少。大部分都被廢棄，這不僅嚴重污染環(huán)境，而且造成資源的極大浪費[13]。因此，魚源膠原的提取不僅可以減少環(huán)境污染，增加企業(yè)經(jīng)濟效益，對提高我國水產(chǎn)加工技術(shù)水平，促進漁業(yè)經(jīng)濟快速發(fā)展具有重要意義[14]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

新鮮草魚魚鱗。

所用化學試劑均為分析純。

DFY-5L40低溫恒溫反應浴，鞏義市予華儀器有限責任公司；Centirfuge 5430R 冷凍離心機，德國Eppendof臺式高速離心機； BSA124S賽多利斯高精度分析天平，上海錫為科學儀器有限公司；BSA124S賽多利斯分析天平，上海錫為科學儀器有限公司；MD 34mm Size 5m MW8000-14000的透析袋，Made In USA。

1.2 實驗方法

新鮮魚鱗用自來水清洗3～4次去除表面雜質(zhì)，室溫晾干12 h。稱取12.5 g魚鱗于250 mL 0.5 %的NaCl溶液中，對魚鱗雜質(zhì)再次清洗，時間為48 h，每12 h換一次溶液。低溫(10 ℃)攪拌，轉(zhuǎn)速20 r/min。

將除雜的魚鱗放入250 mL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液中，攪拌24 h，10 ℃低溫攪拌，轉(zhuǎn)速為20 r/min。

將清洗后的魚鱗加入250 mL 0.5 mol/L pH值=7.5的EDTA-2Na緩沖液中對魚鱗的進行脫鈣處理；脫鈣時間為48 h，每12 h換一次溶液。10 ℃低溫攪拌，轉(zhuǎn)速為15 r/min。脫鈣后的魚鱗加250 mL 0.1 mol/L pH值=8.03 PBS(Na2HPO4-NaH2PO4)緩沖液脫出魚鱗中的雜蛋白48 h，每12 h換一次溶液。10 ℃低溫攪拌，轉(zhuǎn)速為15 r/min。

用250 mL 0.5 mol/L的醋酸溶液對處理好的魚鱗進行膠原蛋白的提??；提取時間48 h，每12 h換一次溶液。10 ℃左右低溫攪拌，轉(zhuǎn)速為15 r/min。所得溶液匯集于1 L的廣口燒瓶中并放入冰箱冷藏(冰箱冷藏室為5 ℃)。最后用濾布過濾收集的提取液，往提取液中添加NaCl粉末時逐漸有沉淀釋出，NaCl濃度至5 %時停止添加。然后在5 ℃下冷凍離心二十分鐘，轉(zhuǎn)速為7500 r/min；取其沉淀再用0.5 mol/L pH值=3.50的醋酸緩沖液250 mL復溶解后再鹽析，5 ℃下冷凍離心后收集沉淀，稱重后加入0.5 mol/L pH值=3.50 約80 mL左右的醋酸緩沖液中溶解冷凍離心的沉淀。

把離心沉淀完全溶解后的溶液加入四個約13 cm長、截留分子量為10000 Da、直徑為3.4 cm的透析袋中，將透析袋置入1 L的燒杯中，加入濃度為0.1 mol/L pH值=3.50的醋酸緩沖液(所加溶液量淹沒透析袋為佳)中透析一天。再換用蒸餾水對透析袋中的樣品透析3天，每12 h換一次蒸餾水。3天后取出透析袋中的樣品放入培養(yǎng)皿中。稱重后，放入冰箱冷凍室預凍；最后再用冷凍干燥機對樣品冷凍干燥，冷凍干燥后得到產(chǎn)品并進行稱重，放入干燥的試樣管中密封低溫冷藏保存。

以上操作換取相同溶液時沒有用蒸餾水清洗過上次處理魚鱗剩下的溶液；換取不同溶液時，都使用蒸餾水清洗2～3次，才加入新的配制溶液。

1.3 性能測試

1.3.1 膠原的分子量測定

SDS-PAGE電泳試驗的譜圖如下：

圖1 草魚魚鱗的SDS-PAGE電泳譜圖Fig.1 SDS-PAGE Electrophoresis Spectrum of Carp

標準蛋白Marker自上而下有8條帶，如圖1所示，分子量區(qū)間為300-40kDa。編號1、2均為提取的膠原蛋白。圖1顯示，有三條明顯的譜帶位于100-130kDa，計算得到三條帶的數(shù)均分子量大致為116kDa，110kDa，104kDa，總數(shù)均分子量為330kDa。兩條α譜帶，α1分布非常寬，說明提取物中肽鏈的分子量及膠原本身的分子量分布有較大范圍的分散。由此判斷產(chǎn)物主要為I型膠原蛋白，還含有部分II型膠原蛋白。

1.3.2 膠原的元素分析

表1 草魚魚鱗膠原蛋白元素分析表Tab.e 1 Analysis Table of Collagen Elements in Grass Carp Scale

膠原蛋白的元素組成：C：50.0%～55.0%，H：6.5%～7.5%，N：15.0%～19.0%，S：0.2%～0.5%[15]。膠原蛋白的元素組成為C、H、N、S，由表可以看出H、S、N的含量均符合比例，C的含量有微小的差別，可能因為魚鱗的種類不同造成的。

1.3.3 膠原的紅外吸收光譜

圖2 草魚膠原蛋白IR譜圖

Fig.2 IR spectra of grass carp collagen

提取物的紅外測試如圖2所示。酰胺A帶位于對應的區(qū)間內(nèi)。酰胺Ⅰ(1638 cm-1)對應于C=O的β-折疊區(qū)間，為膠原多肽組成的骨架，是膠原二級結(jié)構(gòu)變化的特征區(qū)。酰胺Ⅱ(1449 cm-1)和酰胺III(1385 cm-1)也能證明膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

1.3.4 膠原的粉末衍射圖

粉末衍射使用的儀器是德國Bruker D8衍射儀，管電流40 mA，管電壓40 kV，為Cu靶，步長0.03。/步，步速0.1秒/步，采用林克斯陣列式探測器。

圖3 草魚膠原蛋白X射線衍射圖

Fig.3 X-ray Diffraction of Collagen from Grass Carp

由Jade軟件分析，按數(shù)學上的“二階導數(shù)”否為0來自動尋峰。因最終確定的峰如上圖，作表如下：

表2 草魚X射線衍射圖譜對應的D值Tab.e 2 D Value Corresponding to X-ray Diffraction Patterns of Grass Carp

經(jīng)過后期對比分析，取 ?1、?3、?4三個角度為參考，分析得提取的草魚魚鱗的酸溶性膠原蛋白的分子鏈的間距為0.6500 nm，三條鏈簇成膠原蛋白分子的直徑大約1.5nm，符合膠原常規(guī)結(jié)構(gòu)，提取干燥后的膠原蛋白的分子間的范德華力和氫鍵效應減弱不大，生物穩(wěn)定性良好。?3峰對應的數(shù)值在理想的α-螺旋中，螺距為0.95 nm，相鄰氨基酸殘基的距離為0.15 nm。在膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)中，每圈螺旋含有的氨基酸殘基數(shù)與理想的α-螺旋氨基酸殘基數(shù)目有所不同，實驗樣品得到的?4峰對應的d值顯示出膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)上沿旋轉(zhuǎn)中心軸相鄰氨基酸殘基之間的距離為0.2824 nm。說明實驗得到的膠原蛋白保持了較好的生物活性與螺旋結(jié)構(gòu)。

1.3.5 膠原的圓二色圖

圖4 膠原蛋白CD圖Fig.4 Collagen CD Map

圓二色(CD)測試譜圖如上，提取物在221nm波長處有正吸收峰，是左旋聚脯氨酸(P-II)構(gòu)型肽鏈圓二色譜的典型特征，在波長197nm處出現(xiàn)負吸收峰，是膠原分子構(gòu)像中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的特征，CD測試證明了提取膠原三股螺旋的完整性。綜上測試分析證明，本實驗提取產(chǎn)品為純度較高的膠原蛋白纖維。

2 結(jié)果與討論

2.1 五因素混水平實驗設(shè)計

基于文獻分析和對魚鱗膠原提取影響因素的對比試驗結(jié)果，擬采用酸的種類(A)、酸的濃度(B)、提取溫度(C)、提取時間(T)和料液比(E)五個提取因素，為了更好的探究溫度對魚鱗對膠原蛋白的提取率的影響，將溫度因素設(shè)定為四個水平，其余因素均設(shè)定為兩個水平，詳見表3。

表3 實驗因素設(shè)計表Tab.e3 Design table of experimental factors

2.2 結(jié)果和討論

2.2.1 正交實驗表格

將每次試驗的提取率填入表2的提取率對應的一列，并按照相應的算法對正交分析表中的數(shù)據(jù)進行計算，其中，Mij為對應的i水平下的各次實驗提取率求和，yi為第i水平下提取率的平均值，R為每一個因素對應的yi的最大值與最小值的差值，此值的大小可以反映該因素對提取率影響的重要水平。

試驗次數(shù):8

表4 正交分析表Tab.e4 Orthogonal analysis table

注：

2.2.2 正交試驗的結(jié)果分析

(1)直接比較明確實際優(yōu)處理直接比較8個處理的結(jié)果顯示第7個處理的提取率最高，即直接比較的的實際優(yōu)處理是A4B1C2D2E1，其次是第5個處理， A3B1C2D1E2。它們是經(jīng)過試驗的實際處理，結(jié)果較為可靠，可進一步在小范圍內(nèi)試驗及應用。

(2)優(yōu)水平組合提出預測優(yōu)處理

計算正交實驗的數(shù)量結(jié)果，觀察變化的趨勢，找出更好的處理組合。求出各因素相同水平的試驗反應變量指標和，將各因素最好的水平組合在一起，從而提出預測的優(yōu)處理，以供進一步試驗驗證及下一步研究。例如，由表8可以看出，第一列因素A的三個產(chǎn)量之和為10.7064，而因素A第一個水平的平均值為2.6766，將五個因素影響最高的水平組合到一起，得預測的優(yōu)處理，A4B1C2D2E1，即最佳的提取路線：25 ℃、0.5 mol/L的醋酸，以1∶20的料液比提取72 h。

3 極差分析

各水平的平均值y1、y2、y3中最大值減最小值求得極差R。極差大說明此因素的不同水平產(chǎn)生的差異較大，是重要的因素。按照R值大小排列出因素主次序如下表5。

表5 極差分析表Tab.e5 Range analysis table

可以看出，五種因素的主次關(guān)系為：C>D>B>A>E。

4 趨勢圖直觀分析

用MiniTab軟件作田口設(shè)計分析得到如下的主效應圖5。

根據(jù)主效應圖中各因素端點值差值得出影響的因素重要性依次是C>B>A>D>E。E的線段很緩，說明此因素影響不顯著，在做方差分析時，可以剔除該因素。

5 方差分析

表6為正交實驗方差分析表，用來分析各因素對提取率影響的差異。DF為變量的自由度，SS為離差平方和，MS為均方，F(xiàn)代表F統(tǒng)計值，F(xiàn)>Pr代表F統(tǒng)計值的顯著性水平。為了得到更好的分析結(jié)果，把交互作用刪除，然后再進行分析。利用SAS統(tǒng)計分析軟件，按照各因素的主次關(guān)系，剔除E因素之后進行方差分析，得出F值為32.18，顯著性水平為0.1341。為避免測試數(shù)量少對結(jié)果產(chǎn)生的影響，找到影響較大的因素及時刪除不顯著影響因素，避免因素間的交叉作用。由主效應圖進一步剔除因素B，得到F值為1.29，顯著性水平為0.4917；剔除因素A得到的F值為5.51，顯著性水平為0.0664，模型顯著性明顯增加。在剔除其他的因素而分別保留剩余的三個因素的情況下的結(jié)果都沒有只剔除A顯著性高，查資料知[10]，溫度對膠原提取率的影響是成正相關(guān)關(guān)系，所以分析中剔除A因素屬于理論上討論范疇。根據(jù)分析結(jié)果，我們以剔除A的模型為參考，得到如表6的方差分析表。

圖5 主效應圖Fig.5 Main effect diagram

表6 方差分析表Tab.e4 ANOVA Table

注：

最后利用SAS統(tǒng)計分析軟件進行參數(shù)估計，得到的擬合數(shù)學公式：

y=0.61177xa-2.73810xB+3.21370Xc+2.86310Xd+0.40810XE-1.80045

R2=0.8682

3 結(jié)論

五因素混水平的正交實驗得到的最優(yōu)的提取工藝為：25 ℃、0.5 mol/L的醋酸，以1∶20的料液比提取72h。通過統(tǒng)計分析構(gòu)建的提取率和各因素的數(shù)學模型看出，提取率與提取溫度、酸濃度、提取時間、料液比的關(guān)系是正相關(guān)；由模型系數(shù)的絕對值和極差分析結(jié)果得到各因素影響主次為酸濃度、提取時間、酸種類、提取溫度、料液比。本結(jié)論具有統(tǒng)計學意義，能用于魚源膠原基材料的設(shè)計和開發(fā)。