乙烯利和1-MCP對菠蘿蜜果實中AheAAT和AheERF表達的影響

任雪巖，劉光財，李國鵬，葉春海，豐鋒，王俊寧

乙烯利和1-MCP對菠蘿蜜果實中和表達的影響

任雪巖，劉光財，李國鵬，葉春海，豐鋒，王俊寧

（廣東海洋大學農(nóng)學院，廣東湛江 524088）

【】研究乙烯（ETH）和1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）處理對菠蘿蜜果實成熟過程中醇酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）活性、Ahe和AheERF1/2轉(zhuǎn)錄因子表達的影響，為進一步認識菠蘿蜜果實AATs在酯類物質(zhì)合成中的作用及其調(diào)控提供理論依據(jù)。以‘海大2號’菠蘿蜜果實為試材，果實盛花期選擇具有代表性、花期一致的果實掛牌，花后約150 d采收，選擇大小和成熟度相同，且無病蟲傷的果實，分成3組進行處理。第一組采用1 000 mg?L-1ETH溶液浸泡2—3 min；第二組采用0.5 mg?L-11-MCP熏蒸處理15 h；第三組作為對照組。在果實成熟過程中定期取樣，每次取樣3—5個果，測定AAT酶活性、和表達等指標。通過測定AAT酶活性發(fā)現(xiàn)，ETH處理促進了果實的成熟衰老，提前了AAT活性高峰出現(xiàn)的時間，但是降低了酶活性。1-MCP處理抑制了果實成熟衰老，在貯藏前期抑制了AAT的活性，延遲了AAT活性高峰出現(xiàn)的時間，并顯著降低了AAT的活性。對序列分析發(fā)現(xiàn)，其全長1 380 bp，編碼459個氨基酸。AheAAT具有?；D(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域H-x-x-x-D和L-x-x-YYPLAGR活性位點基序，D(N) F(V) GWG附加基序，屬于BAHD醇?；D(zhuǎn)移酶家族，其氨基酸序列與蘋果和梨的相似性最高。同時，從菠蘿蜜果實中克隆獲得2個轉(zhuǎn)錄因子，分別命名為1/2，其中全長648 bp，編碼215個氨基酸，與蘋果和菜豆的同源性最高；全長657 bp，編碼218個氨基酸，與蘋果、番木瓜的同源性最高。的氨基酸序列含有64/65個氨基酸殘基組成的AP2/ERF保守序列，具有ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的特征序列。ETH處理使果實中表達高峰提前出現(xiàn)，并且下調(diào)了的表達。ETH處理對轉(zhuǎn)錄因子的影響與相同，并且ETH降低了轉(zhuǎn)錄因子與的相關性。1-MCP處理延長了菠蘿蜜果實的貯藏期。在1-MCP處理后的貯藏前期，和轉(zhuǎn)錄因子的表達呈現(xiàn)顯著降低。當和轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)表達高峰時，1-MCP下調(diào)了它們的表達。然而，1-MCP對轉(zhuǎn)錄因子與的相關性幾乎無影響。ETH處理提前了AAT的活性高峰及和轉(zhuǎn)錄因子的表達高峰，降低了AAT的活性，下調(diào)了和轉(zhuǎn)錄因子的表達，降低了與轉(zhuǎn)錄因子的相關性。1-MCP處理在貯藏前期抑制了AAT的活性及和轉(zhuǎn)錄因子的表達，在貯藏后期降低了AAT的活性，下調(diào)了和轉(zhuǎn)錄因子的表達量。

菠蘿蜜；乙烯利；1-MCP；

0 引言

【研究意義】菠蘿蜜（Lam.）染色體2n=56，是?？颇静ぬ}屬喬木，為熱帶著名水果，果肉柔軟，清甜可口，香氣濃郁，有“熱帶水果皇后”之稱。菠蘿蜜為典型的呼吸躍變型水果，成熟與乙烯代謝密切相關[1]，外源乙烯利（ETH）可加快其成熟和衰老，1-甲基環(huán)丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）作為一種穩(wěn)定的乙烯受體抑制劑，可有效抑制菠蘿蜜果實的成熟和衰老[2]，能夠較長時間保持菠蘿蜜果實品質(zhì)的優(yōu)良。香氣是衡量果實品質(zhì)的重要指標之一。菠蘿蜜的主要香氣成分以酯類物質(zhì)為主，酯類占到香氣總量的一半以上，因此酯類物質(zhì)構(gòu)成了菠蘿蜜的風味骨架[3]。醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）是酯合成末端的關鍵酶，催化醇亞基和?；?CoA合成不同的酯類香氣物質(zhì)[4]。轉(zhuǎn)錄因子是乙烯信號轉(zhuǎn)導通路最下游的關鍵因子，對乙烯信號轉(zhuǎn)導通路有重要的影響[5]。通過識別乙烯反應元件中的GCC-box，來實現(xiàn)或阻遏乙烯的反應。因此，開展相關研究，可以為進一步認識菠蘿蜜果實AATs在酯類物質(zhì)合成中的作用及其調(diào)控提供理論依據(jù)，為菠蘿蜜品種選育，調(diào)控菠蘿蜜果實中酯類物質(zhì)含量，延長菠蘿蜜果實采后貯藏時間及提高菠蘿蜜果實的風味品質(zhì)提供參考?！厩叭搜芯窟M展】前人研究發(fā)現(xiàn)甜瓜、蘋果和香蕉中AAT的活性與酯類物質(zhì)含量表現(xiàn)出正相關[6]。已得到AAT酶基因序列的物種有草莓、甜瓜、木瓜和桃等。NORDSTR?M[7]和其他研究指出，酵母中的酯是在酯合成酶或?；D(zhuǎn)移酶的作用下，由?；o酶A的參與和能量供應來合成的。通過對該酶的初步研究，發(fā)現(xiàn)其定位于細胞膜[8]。仙女扇花中的和是從植物中得到的第一個，它們屬于醇?；D(zhuǎn)移酶的BAHD家族，該家族具有H-x-x-x-D和L-x-x-x-Y-x-x-x-AG活性位點基序，還有FGWG的附加基序[9]。甜瓜果實中含有4個家族成員，除無活性外，其他3個基因都能夠合成酯類物質(zhì)，通過定點突變試驗發(fā)現(xiàn)，CmAAT2蛋白中268位的蘇氨酸被丙氨酸取代[10]。馮燕青[11]從自交系甜瓜中克隆得到，發(fā)現(xiàn)該基因的表達量在花后15 d的果實中最低，等果實完全成熟后其表達量達最高值。草莓果實中的轉(zhuǎn)錄水平隨著果實的發(fā)育成熟而增強，果實香氣中的酯類物質(zhì)升高，醛類物質(zhì)下降[12]。CUMPLIDO-LASO等[13]發(fā)現(xiàn)草莓中的可以催化C1—C8的芳族醇、直鏈醇和?；?CoA反應產(chǎn)生酯類物質(zhì)。通過下調(diào)草莓果實中的表達，果實中酯類物質(zhì)含量明顯減少，表明是酯類物質(zhì)合成的關鍵基因。ERF（Ethylene-responsive transcription factors）類轉(zhuǎn)錄因子在植物的生育過程和抗逆過程中具有關鍵的效果，其家族蛋白都含有60—70個氨基酸組成的AP2保守結(jié)構(gòu)域[14]。研究發(fā)現(xiàn)蘋果中的參與了果實的成熟與衰老，其中和在成熟過程中和后熟過程中分別表達上調(diào)，并且可被1-MCP抑制表達[15]。YIN等[16]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃果實中的13個轉(zhuǎn)錄因子在水果發(fā)育的早期表達，其中有5個基因為下調(diào)表達，4個基因上調(diào)表達，并且上調(diào)表達可被1-MCP抑制，還有4個基因表達無明顯變化趨勢。龍眼果實中的兩個在貯藏期間表現(xiàn)上調(diào)，并且通過乙酰化酶D1HD2互作來調(diào)控龍眼果實衰老的相關基因[17]。因此可知，在果實的生長發(fā)育進程中具有關鍵作用。【本研究切入點】在菠蘿蜜果實的貯藏加工中，如何保持其優(yōu)良的風味和品質(zhì)是菠蘿蜜貯藏加工的重要任務。對躍變型水果來說，為了調(diào)控其市場供應，常用乙烯利和1-MCP處理來分別對果實進行催熟和抑制成熟。菠蘿蜜是典型的躍變型果實，外源ETH和1-MCP處理也可以分別促進其成熟和抑制其成熟，但有關ETH和1-MCP處理對菠蘿蜜中香氣形成過程中酶和基因表達影響的研究還未見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過分析對照（CK）、外源ETH和1-MCP處理菠蘿蜜果實成熟過程中AAT活性、及1/2轉(zhuǎn)錄因子表達的變化情況，探討ETH、1-MCP對菠蘿蜜AAT活性和表達的調(diào)控作用，分析1/2轉(zhuǎn)錄因子與的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為香氣濃郁的干苞型菠蘿蜜品種‘海大2號’果實。在果實盛花期選擇具有代表性、花期一致的果實掛牌，花后約150 d采收。采收后立即將果實運回實驗室，選擇大小和成熟度相同，且無病蟲傷的果實，分3組進行處理。第一組果實采用1 000 mg?L-1ETH溶液浸泡2—3 min，然后取出晾干；第二組果實采用0.5 mg?L-11-MCP熏蒸處理15 h；第三組作為對照（CK）。三組材料在22℃、90%的相對濕度條件下，讓其自然成熟。在果實成熟過程中定期選取果實取樣，每次取樣3—5個果，取樣時將果肉從菠蘿蜜果實中分離出來，切成5 mm×5 mm的碎片，混勻裝入鋁箔袋密封，液氮速凍后，存于-80℃超低溫冰箱中。

1.2 試劑

北京華越洋RNA提取試劑盒，TaKaRa cDNA合成試劑盒，pMDR20 T-Vector*1載體，DH5α感受態(tài)細胞，DNA快速回收純化試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）。

Bio-Rad CFX Connect實時定量PCR儀。QPCR試劑盒SYBR（TransStartTop Green qPCR SuperMix）和質(zhì)粒抽提試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）等。?；D(zhuǎn)移酶活性測定試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）。

1.3 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

使用華越洋Plant RNA Kit超快型植物RNA提取試劑盒提取菠蘿蜜總RNA。以菠蘿蜜果實RNA為模板，采用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.4 PCR引物設計及合成

用Primer Premier 5.0軟件設計和的全長引物，委托上海生物工程有限公司合成（表1）。

經(jīng)過PCR擴增，目的片段回收，連接轉(zhuǎn)化，陽性克隆檢測測序，得到和的全長序列。

表1 基因全長引物序列

1.5 qPCR引物設計及qPCR程序

根據(jù)全長和轉(zhuǎn)錄組庫中的1/2全長設計熒光定量引物（表2）。

qPCR擴增程序采用三步法，程序如下：94℃ 1 min；94℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，39個循環(huán)。

表2 定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 菠蘿蜜AheAAT、AheERF1和AheERF2的克隆

從菠蘿蜜果實轉(zhuǎn)錄組庫中，分別挑選到1個AAT和2個ERF轉(zhuǎn)錄因子的序列，通過設計3′RACE、5′RACE和全長引物，經(jīng)過一系列的擴增、測序過程，最終獲得這3個基因的全長cDNA序列，分別命名為、和。如圖1所示，、和全長分別為1 380、648和657 bp。

2.2 AheAAT編碼蛋白特征序列和理化性質(zhì)分析

基因的編碼區(qū)長1 380 bp，編碼459個氨基酸，利用ProtParam軟件對基因所編碼的蛋白進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，其分子式為C2276H3587N615O660S27，分子量為50.99 kD。所編碼的蛋白的氨基酸組成中，亮氨酸（Leu）的含量最高，占總氨基酸的9.6%；脯氨酸（Pro）和纈氨酸（Val）的含量次之，都為7.2%。AheAAT蛋白的等電點為8.33，脂肪系數(shù)為84.53。平均親水性為-0.147，屬于疏水性蛋白；不穩(wěn)定性系數(shù)為39.11，為穩(wěn)定性蛋白。

M：DNA Marker DL 2 000 bp

通過NCBI進行序列比對分析，將推導的氨基酸序列與GenBank中登錄的蘋果、梨、枇杷、葡萄、草莓、茶、柿的酰基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列進行比對（圖2）。發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列與蘋果和梨的相似性最高，分別為66.83%和66.17%。由圖2可知具有?；D(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域H-x-x-x-D（173—177氨基酸殘基）和L-x-x-YYPLAGR（82—91氨基酸殘基）活性位點基序，D(N) F(V) GWG（396—400氨基酸殘基）附加基序，所以，屬于BAHD醇酰基轉(zhuǎn)移酶家族。

采用以上蛋白比對結(jié)果，使用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由圖3可知，這些物種的蛋白共形成4個分支，蘋果（AY517491.1、AY512893.1、KC291133.1、KC291132.1）、梨（AY534530.1、KJ775788.1）、柿（KP271995.1）、枇杷（KF704125.2）等水果聚為一支，葡萄（KX963771.1、AY705388.1）和茶（GQ438850.1）聚為一支，草莓（JN089766.1）和菠蘿蜜（AheAAT）各為一支。

2.3 AheERF1轉(zhuǎn)錄因子分析

利用ProtParam軟件對菠蘿蜜中轉(zhuǎn)錄因子序列進行分析，顯示轉(zhuǎn)錄因子全長648 bp，編碼215個氨基酸，其蛋白理論分子質(zhì)量為24.05 kD，等電點pI=8.81，平均親水系數(shù)為-0.717，不穩(wěn)定指數(shù)為45.91，脂肪系數(shù)為60.84。組成該蛋白的氨基酸中蘇氨酸含量最高為13.5%，其次為絲氨酸8.8%。

圖2 AheAAT與其他物種AAT蛋白序列比對（保守結(jié)構(gòu)域用紅色方框標出）

圖3 AheAAT系統(tǒng)發(fā)育樹

將推導的氨基酸序列與蘋果、葡萄、草莓、柿、獼猴桃和擬南芥等ERF的氨基酸序列進行比對，如圖4。推測出的氨基酸序列含有64個氨基酸殘基組成的AP2/ERF保守序列（圖4中藍色方框），該保守序列是植物中ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的特征序列。由圖可知ERF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸全長序列同源性較低，其保守性只來自保守區(qū)，其他區(qū)域具有較大的差異，構(gòu)成了轉(zhuǎn)錄因子的特征。

采用以上蛋白比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5。由圖5可知，菠蘿蜜中AheERF1與蘋果（GU732445.1）、和菜豆（XM-007136909.1）的同源性最高，其次是葡萄（KX179904.1）、草莓（MH332939.1）和櫻桃（KT369551.1），這6個物種的ERF聚為一支。海島棉（KC969205.1）和擬南芥（AY059664.1）聚為一支，柿子（KJ170916.1）和獼猴桃（MH105005.1）聚為一支。菜豆（XM-007135737.1）和油桐（KX868905.1）聚為一支。

2.4 AheERF2轉(zhuǎn)錄因子分析

利用ProtParam軟件對菠蘿蜜中轉(zhuǎn)錄因子序列進行分析，顯示轉(zhuǎn)錄因子全長657 bp，編碼218個氨基酸，其蛋白理論分子質(zhì)量為24.53 kD，等電點pI=5.10，平均親水系數(shù)為-0.542，不穩(wěn)定指數(shù)為62.45，脂肪系數(shù)為70.18。組成該蛋白的氨基酸中絲氨酸含量最高為13.8%，其次為谷氨酸12.4%。

將AheERF2推導的氨基酸序列與蘋果、葡萄、草莓、柿、獼猴桃和擬南芥等ERF的氨基酸序列進行比對，如圖6。推測出AheERF2的氨基酸序列含有65個氨基酸殘基組成的AP2/ERF保守序列（圖6中藍色方框），該保守序列是植物中ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的特征序列。由圖可知ERF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸全長序列同源性較低，其保守性只來自保守區(qū)，其他區(qū)域具有較大的差異，構(gòu)成了轉(zhuǎn)錄因子的特征。

采用以上蛋白比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7。由圖7可知菠蘿蜜中AheERF2與蘋果（GU732453.2）、番木瓜（KM453704.1）、丹參（MH006599.1）、柿（MH054905.1，KJ170919.1）、草莓（MH332989.1）同源性最高，其次是獼猴桃（KC907726.1，GQ869861.1）、菜豆（XM 007144028.1）、百脈根（AB378626.1）、白樺（KM980452.1），這9個物種聚為一支。葡萄（KF207890.1）、擬南芥（AY133629.1）和菜豆（XM 007134417.1）各單獨聚為一支。木油桐（KX868845.1）和毛果楊（XM 002315671.1）聚為一支。

2.5 不同處理對菠蘿蜜果實中AAT酶活性的影響

不同處理下菠蘿蜜果實中AAT活性的變化如圖8所示。由圖可知，3種處理下菠蘿蜜后熟過程中AAT活性的變化隨著貯藏天數(shù)的增加表現(xiàn)為先增加后降低。菠蘿蜜果實在正常后熟過程中，其體內(nèi)的AAT活性在第8天達到最大值。ETH處理提前了AAT的活性高峰，并稍微降低了酶活，降低8.85%。1-MCP處理在貯藏前期抑制了AAT的活性，推遲了AAT活性出現(xiàn)的高峰，在采后第16天才出現(xiàn)高峰，并且1-MCP降低了AAT的活性，降低33.18%。

圖4 AheERF1與其他物種ERF蛋白序列比對（紅色方框為保守結(jié)構(gòu)域，藍色方框為保守元件）

圖5 AheERF1系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 AheERF2與其他物種ERF蛋白序列比對（紅色方框為保守結(jié)構(gòu)域，藍色方框為保守元件）

圖7 AheERF2系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 不同處理對果實AAT酶活性的影響

2.6 不同處理對AheAAT表達的影響

在貯藏不同時期的表達量如圖9。由圖可知，不同處理下的表達量在菠蘿蜜果實貯藏過程中存在差異。ETH處理后，的表達相比CK提前了4 d，并且ETH下調(diào)了的表達。1-MCP在菠蘿蜜貯藏的前期抑制了的表達，在貯藏第16天，的表達達到最大值，并且1-MCP處理也下調(diào)了的表達，下調(diào)了53.71%。

圖9 不同處理對果實AheAAT表達的影響

2.7 不同處理對AheERF1和AheERF2表達的影響

不同處理AheERF1/2的表達如圖10。在正常后熟過程中，ERF1的表達量從4 d時開始增加，第8天時，ERF1的表達量達到最大值，之后開始下降；的表達從第2天開始逐漸增加，到貯藏第8天時該基因的表達量達到最大值，之后開始下降。ETH處理將和表達高峰的時間提前，并且ETH降低和的表達量。1-MCP處理在貯藏前期抑制了和的表達，在貯藏第12天表達量開始增加，在第16天達到最大值，之后一直下降，在貯藏14 d時表達量開始增加，在貯藏第16天時達到最大值，然后持續(xù)下降。菠蘿蜜果實中的表達豐度高于。

圖10 不同處理對果實AheERF1/2表達的影響

2.8 AheAAT與AheERF1和AheERF2轉(zhuǎn)錄因子的相關性分析

由表3可知，對照中與、轉(zhuǎn)錄因子的相關系數(shù)分別為0.993、0.956，呈極顯著相關性（＜0.01）。說明和轉(zhuǎn)錄因子在菠蘿蜜果實中的表達對的表達有直接影響作用。

ETH處理后，菠蘿蜜果實中與、轉(zhuǎn)錄因子的相關系數(shù)分別為0.965、0.915，與轉(zhuǎn)錄因子極顯著相關，與轉(zhuǎn)錄因子顯著相關。ETH處理降低了轉(zhuǎn)錄因子與的相關性，對轉(zhuǎn)錄因子的影響較小。

1-MCP處理中，與、轉(zhuǎn)錄因子的相關系數(shù)分別為0.968、0.817，均為極顯著相關（＜0.01）。1-MCP處理對和轉(zhuǎn)錄因子的影響較小。

表3 AheAAT與AheERF1、AheERF2的相關性分析

**在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關；*在0.05水平（雙側(cè)）上顯著相關

** Significant correlation at 0.01 level (both sides); * Significant correlation at 0.05 level (both sides)

3 討論

AAT酶是果實中酯類合成最末端的關鍵酶，具有極其重要的作用。張麗萍等[18]發(fā)現(xiàn)使用2 mmol?L-1外源乙烯處理1-MCP處理后的南國梨果實，提高了AAT酶的活性。隋靜[19]采用不同濃度的ETH處理草莓果實，發(fā)現(xiàn)AAT酶活性隨乙烯濃度增加同步提高。本研究發(fā)現(xiàn)ETH處理提前了AAT活性高峰出現(xiàn)的時間，但是降低了酶活性，與張麗萍[18]和隋靜[19]等的研究結(jié)果不同，可能是因為果實的品種和對果實的處理不同，導致結(jié)果的相反。DEFILIPPI等[20]在蘋果中發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理降低了AAT酶的轉(zhuǎn)錄水平，降低了酶活性，但不影響乙醇脫氫酶的活性。在甜瓜采收前3 d施用1-MCP處理，發(fā)現(xiàn)AAT活性明顯被抑制[21]。本研究發(fā)現(xiàn)1-MCP處理在貯藏前期抑制了AAT的活性，延遲了AAT活性高峰出現(xiàn)的時間，并顯著降低了AAT酶的活性。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相似。

草莓果實中的，全長1 618 bp，編碼452個氨基酸，分子量約50.7 kD[22]。從Charentais甜瓜中克隆出兩個，和均編碼461個氨基酸，分子量分別為51.5 kD和51.8 kD，等電點分別為8和8.5。HEALIT等[23]在玫瑰花的EST序列中發(fā)現(xiàn)3個與已知其他來源的BAHD家族基因相似，其中一個編碼458個氨基酸的序列，命名為，其分子量為51.8 kD，等電點為5.45，該序列與草莓果實中的SAAT蛋白有69%的同源性，其屬于BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族。LI等[24]在‘喬納金’和‘金冠’蘋果果實中分別克隆到和，兩個基因的全長分別為1 639 bp和1 628 bp，二者的同源性為94.26%。分析序列后發(fā)現(xiàn)，含有保守區(qū)H-x-x-x-D和FGWG。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，蛋白與梨果實中的AAT蛋白親緣關系最近，與草莓、檸檬等的親緣關系較遠。本研究得到的菠蘿蜜中的AAT氨基酸序列與蘋果中的AAT氨基酸序列具有較高的相似性，存在H-x-x-x-D、L-x-x-x-Y-x-x-x-AG和FGWG保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜單獨聚為一類，與其他物種的進化關系較遠。

乙烯應答因子結(jié)合蛋白是廣泛存在于植物中的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族。該家族成員均含有約60個氨基酸的保守AP2/EREBP結(jié)合域。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和相似性，可將AP2/ERF家族分為AP2、ERF和RAV三個亞家族[25-26]。

從菠蘿蜜果肉中克隆得到的兩個轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白都具有ERF家族的典型結(jié)構(gòu)特性。AheERF1和AheERF2均含有1個高度保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。AheERF1蛋白的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域由64個氨基酸殘基組成，存在于該蛋白的前部。AheERF2蛋白的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域由65個氨基酸殘基組成，存在于該蛋白的中部。在AP2/ERF結(jié)構(gòu)域含有YRG或RAYD保守的元件[27]，其中20個左右的氨基酸殘基構(gòu)成了YRG元件，并且大部分氨基酸為堿性氨基酸，有利于DNA與其結(jié)合。大約40個氨基酸殘基構(gòu)成了RAYD保守元件，其影響YRG元件的構(gòu)象，還可以和其他蛋白進行互作，調(diào)節(jié)DNA序列和AP2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。AheERF1蛋白中含有YRG和RAYD保守元件，位于8—10位和45—48位，AheERF2蛋白含有YRG保守元件，位于92—94位。

的表達水平在果實成熟過程中受乙烯的調(diào)控[28]。YAHYAOUI等[21]在甜瓜果實中發(fā)現(xiàn)1-MCP對和的轉(zhuǎn)錄和表達有明顯的抑制作用，也抑制了乙烯的產(chǎn)生。在蘋果中，1-MCP抑制了的表達和乙烯、酯類物質(zhì)的合成，1-MCP+ ETH處理可以誘導表達，并部分恢復乙烯和酯類物質(zhì)的合成[29]。木瓜果實中的參與了香氣物質(zhì)的形成，該基因受到乙烯的調(diào)控[30]。本研究發(fā)現(xiàn)ETH提前了表達高峰出現(xiàn)的時間，并且下調(diào)了的表達。1-MCP處理在貯藏前期抑制了的表達，延遲了表達高峰出現(xiàn)的時間，下調(diào)了的表達。與前人研究結(jié)果類似。

常博文等[31]在長春花中發(fā)現(xiàn)，ETH處理促進了轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，加強了細胞內(nèi)的乙烯信號。LEI等[32]從‘蜻蜓’鳳梨中得到3個家族基因，發(fā)現(xiàn)這3個基因受到外源乙烯的調(diào)控，且表達量受到正調(diào)控。張紅娜等[33]在對‘巴厘’和‘臺農(nóng)16’菠蘿品種的研究中發(fā)現(xiàn)，‘巴厘’品種中受到外源ETH的正調(diào)控，并在處理后1 d出現(xiàn)表達高峰；‘臺農(nóng)16’品種呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)ETH處理提前了菠蘿蜜果實中表達高峰出現(xiàn)的時間，下調(diào)了的表達。菠蘿蜜中與長春花、‘蜻蜓’鳳梨和‘巴厘’菠蘿中的研究結(jié)果相反，但是與‘臺農(nóng)16’菠蘿的研究結(jié)果相似。

1-MCP處理對轉(zhuǎn)錄因子的影響研究較少。1-MCP處理在菠蘿蜜后熟過程的前期抑制了轉(zhuǎn)錄因子的表達，在后熟過程的后期果實中產(chǎn)生新的乙烯受體，的表達恢復正常，但是受到1-MCP的影響，其后期的表達量下降，并且和的表達豐度不同。

通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，的表達與、轉(zhuǎn)錄因子極顯著相關，暗示和轉(zhuǎn)錄因子對的表達有調(diào)控作用，具體機理有待進一步研究。

4 結(jié)論

ETH處理提前了AAT的活性高峰，降低了AAT的活性。1-MCP處理在貯藏前期抑制了AAT的活性，在貯藏后期降低了AAT的活性。全長1 380 bp，編碼459個氨基酸，氨基酸序列中存在H-x-x-x-D、L-x-x-x-Y-x-x-x-AG和FGWG保守結(jié)構(gòu)域，屬于醇?；D(zhuǎn)移酶的BAHD家族。氨基酸序列同源比對發(fā)現(xiàn)，與蘋果果實中的AAT氨基酸序列有較高的相似性，與其他物種的進化關系較遠。ETH處理使果實中表達高峰提前出現(xiàn)，并且下調(diào)了的表達。ETH處理對轉(zhuǎn)錄因子的影響與相同，并且ETH降低了轉(zhuǎn)錄因子與的相關性。1-MCP處理延長了菠蘿蜜果實的貯藏期，在貯藏前期，和轉(zhuǎn)錄因子的表達呈現(xiàn)顯著降低；當和轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)表達高峰時，1-MCP下調(diào)了其表達。

[1] 王俊寧, 馬靜, 豐鋒, 楊轉(zhuǎn)英, 葉春海. 乙烯對采后菠蘿蜜果實碳水化合物代謝及其酶活性的影響. 江西農(nóng)業(yè)大學學報, 2017, 39(1): 43-49.

WANG J N, MA J, FENG F, YANG Z Y, YE C H. Effects of ethylene on carbohydrate metabolism and enzyme activities in postharvest ripening jackfruit., 2017, 39(1): 43-49. (in Chinese)

[2] 謝忠斌, 葉春海, 任雪巖, 豐峰, 王俊寧. 1-MCP和乙烯利處理對采后菠蘿蜜果實活性氧代謝的影響. 熱帶作物學報, 2018, 39(1): 77-83.

XIE Z B, YE C H, REN X Y, FENG F, WANG J N. Effects of 1-MCP and ethephon treatment on reactive oxygen metabolism of postharvest jackfruit., 2018, 39(1): 77-83. (in Chinese)

[3] 王俊寧, 任雪巖, 余樹明, 何啟朋, 豐鋒, 劉光財, 葉春海. 9個菠蘿蜜品系香氣成分及特征香氣分析. 果樹學報, 2018, 35(5): 574-585.

WANG J N, REN X Y, YU S M, HE Q P, FENG F, LIU G C, YE C H. Analysis of aroma compounds in 9 jackfruit varieties., 2018, 35(5): 574-585. (in Chinese)

[4] 隋靜, 姜遠茂, 彭福田, 國穎, 劉丙花, 趙鳳霞, 王海云. 草莓果實發(fā)育過程中芳香物質(zhì)含量和醇?；D(zhuǎn)移酶活性的變化. 園藝學報, 2007, 34(6): 1411-1417.

SUI J, JIANG Y M, PENG F T, GUO Y, LIU B H, ZHAO F X, WANG H Y. Development of aroma components and alcohol acyltransferase activity in strawberry fruit during ripening., 2007, 34(6): 1411-1417. (in Chinese)

[5] Yang Y X, Ahammed G, Wu C J, Fan S Y, Zhou Y H. Crosstalk among jasmonate, salicylate and ethylene signaling pathways in plant disease and immune responses.2015, 16(5): 450-461.

[6] 曹穎, 胡尚連, 張慧瑩, 唐曉鳳, 劉永勝. 番茄醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因. 植物研究, 2012, 32(6): 731-736.

CAO Y, HU S L, ZHANG H Y, TANG X F, LIU Y S.Cloning, sequence analysis and prokaryotic expression of an alcohol acyltransferase (AAT) gene in tomato ()., 2012, 32(6): 731-736. (in Chinese)

[7] Nordstr?m K. Formation of ethyl acetate in fermentation with brewer’s yeast. III. participation of coenzyme A., 1962, 68(5): 398-407.

[8] Yoshioka K, Hashimoto N. Ester formation by alcohol acetyltransferase from brewers’ yeast., 1981, 45(10): 2183-2190.

[9] Stpierre B, Luca V D. Chapter nine evolution of acyltransferase genes: origin and diversification of the BAHD superfamily of acyltransferases involved in secondary metabolism., 2000, 34: 285-315.

[10] EL-SHARKAWY I, MANRíQUEZ D, FLORES F B, REGAD F, BOUZAYEN M, LATCHé A, PECH J C. Functional characterization of a melon alcohol acyl-transferase gene family involved in the biosynthesis of ester volatiles. Identification of the crucial role of a threonine residue for enzyme activity., 2005, 59(2): 345-362.

[11] 馮燕青. 甜瓜果實醇?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆和表達及其對番茄的遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學, 2009.

FENG Y Q.Cloning and characterization of alcohol acyltransferase encoding genes from muskmelon and transformating antisense vector to tomato [D]. Tai’an:, 2009. (in Chinese)

[12] GONZáLEZ M, GAETEEASTMAN C, VALDENEGRO M, FIGUEROA C R, FUENTES L, HERRERA R, MOYA-LEóN M A. Aroma development during ripening of fragaria chiloensis fruit and participation of an alcohol acyltransferase () gene., 2009, 57(19): 9123-9132.

[13] CUMPLIDO-LASO G, MEDINA-PUCHE L, MOYANO E, HOFFMANN T, SINZ Q, RING L, STUDART-WITTKOWSKI C, CABALLERO JL, SCHWAB W, MU?OZ-BLANCO J, BLANCO- PORTALES R. The fruit ripening-related geneencodes an acyl transferase involved in strawberry aroma biogenesis., 2012, 63(11): 4275-4290.

[14] OKAMURO J K, CASTER B, VILLARROEL R, MONTAGU M, JOFUKU K D. The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in., 1997, 94(13): 7076-7081.

[15] WANG A D, TAN D M, TAKAHASHI A, LI T Z, HARADA T., two ethylene-response factors involved in apple fruit ripening., 2007, 58(13): 3743-3748.

[16] YIN X R, ALLAN A C, CHEN K S, FERGUSON I B. Kiwifruitandgenes involved in regulating fruit ripening., 2010, 153(3): 1280-1292.

[17] KUANG J F, CHEN J Y, LUO M, WU K Q, SUN W, JIANG Y M, LU W J. Histone deacetylase HD2 interacts withand is involved in longan fruit senescence., 2012, 63(1): 441-454.

[18] 張麗萍, 紀淑娟. 乙烯利對1-MCP處理南果梨冷藏后香氣及香氣合成過程中關鍵酶活的影響. 食品科學, 2013, 34(10): 294-298.

ZHANG L P, JI S J.Effect of Different concentrations of ethephon on aroma and key enzymes related to aroma formation in 1-MCP-treated nanguo pear after refrigerated storage., 2013, 34(10): 294-298. (in Chinese)

[19] 隋靜. 草莓果實發(fā)育過程和采后處理對其芳香物質(zhì)和醇?；D(zhuǎn)移酶活性影響研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學, 2007.

SUI J.Effects of fruit development period and post-harvest treatment on aromatic substances and AAT activity in strawberry [D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2007. (in Chinese)

[20] DEFILIPPI B G, DANDEKAR A M, KADER A A. Impact of suppression of ethylene action or biosynthesis on flavor metabolites in apple (Borkh) fruits., 2004, 52(18): 5694-5701.

[21] YAHYAOUI F E, WONGS-AREE C, LATCHé A, HACKETT R, GRIERSON D, PECH J C. Molecular and biochemical characteristics of a gene encoding an alcohol acyl-transferase involved in the generation of aroma volatile esters during melon ripening., 2002, 269(9): 2359-2366.

[22] AHARONI A, KEIZER L C, BOUWMEESTER H J, SUN Z, ALVAREZ- HUERTA M, VERHOEVEN H A, BLAAS J, HOUWELINGEN A M, DE VOS R C, VAN DER VOET H, JANSEN R C, GUIS M, MOL J, DAVIS R W, SCHENA M, TUNEN A J, O'CONNELL A P. Identification of thegene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays., 2000, 12(5): 647-662.

[23] SHALIT M, GUTERMAN I, VOLPIN H, BAR E, TAMARI T, MENDA N, ADAM Z, ZAMIR D, VAINSTEIN A, WEISS D, PICHERSKY E, LEWINSOHN E. Volatile ester formation in roses. Identification of an acetyl- coenzyme A. Geraniol/Citronellol acetyltransferase in developing rose petals., 2003, 131(4): 1868-1876.

[24] LI D P, XU Y F, XU G M, GU L K, LI D Q, SHU H R. Molecular cloning and expression of a gene encoding alcohol acyltransferase () from apple (cv. Golden Delicious)., 2006, 67(7): 658-667.

[25] HU L F, LIU S Q. Genome-wide identification and phylogenetic analysis of thegene family in cucumbers., 2011, 34(4): 624-633.

[26] RAO G D, SUI J K, ZENG Y F, HE C Y, ZHANG J G. Genome-wide analysis of the AP2/ERF gene family in., 2015, 5: 132-137.

[27] MAZAREI M, PUTHOFF D P, HART J K, RODERMEL S R, BAUM T J. Identification and characterization of a soybean ethylene- responsive element-binding protein gene whose mRNA expression changes during soybean cyst nematode infection., 2002, 15(6): 577-586.

[28] DEFILIPPI B G, JUAN W S, VALDéS H, MOYA-LEóN M A, INFANTE R, CAMPOS-VARGAS R. The aroma development during storage ofas evaluated by gas chromatography, electronic nose, and sensory analysis., 2009, 51(2): 212-219.

[29] 李大鵬. 蘋果醇?；D(zhuǎn)移酶基因參與酯類香氣合成調(diào)控機理的研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學, 2005.

LI D P. Expression characterization of thegene and its regulation mechanism of volatile ester biosynthesis in apple (cv. Golden Delicious)[D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2005. (in Chinese)

[30] BALBONTIN C, GAETE-EASTMAN C, FUENTES L, FIGUEROA C R, HERRERA R, MANRIQUEZ D, LATCHé A, PECH J C, MOYA-LEóN M A., a gene encoding an alcohol acyltransferase, is involved in ester biosynthesis during ripening of mountain papaya fruit., 2010, 58(8): 5114-5121.

[31] 常博文, 劉杰, 鐘鵬, 郭曉瑞. 外源乙烯對長春花生理水平和生物堿積累的影響. 植物研究, 2018, 38(2): 284-291.

CHANG B W, LIU J, ZHONG P, GUO X R.Effects of exogenous ethylene on physiology and alkaloid accumulations in., 2018, 38(2): 284-291. (in Chinese)

[32] LEI M, LI Z Y, WANG J B, FU Y L, AO M F, XU L., An age-dependent gene of, responds to exogenous ethylene treatment., 2016, 17(3): 303.

[33] 張紅娜, 劉勝輝, 孫偉生, 李運合, 孫光明, 林文秋, 張秀梅, 吳青松. 菠蘿對乙烯利誘花的敏感性差異研究. 熱帶作物學報, 2018, 39(6): 1087-1094.

ZHANG H N, LIU S H, SUN W S, LI Y H, SUN G M, LIN W Q, ZHANG X M, WU Q S.Ethylene induced sensitivity of difference pineapple varieties., 2018, 39(6): 1087-1094. (in Chinese)

Effects of Ethephon and 1-MCP on the Expression ofGene andTranscription Factors in Jackfruit Fruit

REN XueYan, LIU GuangCai, LI GuoPeng, YE ChunHai, FENG Feng, WANG JunNing

(Agricultural College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, Guangdong)

【】The effects of Ethephon (ETH) and 1-methylcyclopropene (1-MCP) on AAT activities, the expression ofgene andtranscription factor were studied during ripening of jackfruit to provide a theoretical basis for further understanding the role of AATS in the synthesis of esters and its regulation. 【】The test material was jackfruit of Haida2. During the full bloom period, the fruit with the representative flowering period was labeled and harvested about 150 days after flowering. The fruits with the same size and maturity and no disease and insect damage were selected to divide into three groups for treatment. The first group was immersed in 1 000 mg?L-1ETH solution for 2-3 min; the second group was fumigated with 0.5 mg?L-11-MCP for 15 h; the third group, as a control group, was naturally matured at 22℃ and 90% relative humidity conditions. During fruit ripening, samples were taken periodically with 3-5 fruits per times. The flesh of the jackfruit was frozen in liquid nitrogen and then stored in an ultra-low temperature refrigerator at -80℃for determination of AAT activities, the expression ofgene andof jackfruit.【】By analyzing the activity of AAT enzyme, it was found that ETH treatment promoted the ripening and senescence of jackfruit, advanced the peak of the activity peak of AAT, but reduced AAT enzyme activity. 1-MCP treatment inhibited the ripening and senescence of fruits by inhibiting the AAT activity in the pre-storage period, delaying the time of peak AAT activity, and significantly reducing the activity of AAT enzyme. Sequence analysis ofgene showed that the total length ofgene was 1 380 bp, encoding 459 amino acids.had a conserved domain H-x-x-x-D and an L-x-x-YYPLAGR active site motif, a D(N)F(V) GWG add-on motif. Thegene belonged to the BAHD alcohol acyltransferase family, and its amino acid sequence had the highest similarity to apples and pears. At the same time, two ERF transcription factors, named, were cloned from the fruit of jackfruit, of whichwas 648 bp in length, encoding 215 amino acids, and had the highest homology with apple and kidney bean.was 657 bp in length, encoding 218 amino acids, with the highest homology with apples, papaya. The amino acid sequence of AheERF1/2 contained an AP2/ERF conserved sequence consisting of 64/65 amino acid residues and had a characteristic sequence of an ERF family transcription factor. ETH treatment advanced the expression peak ofgene in jackfruits and down-regulated its expression. The effects of ETH treatment on the expression oftranscription factor were identical to that ofgene. ETH treatment decreased the correlation betweengene andtranscription factor. 1-MCP treatment prolonged the storage period of jackfruit fruit. 1-MCP treatment prolonged the storage period of jackfruit fruit. The expression ofgene andtranscription factors were significantly reduced during the pre-storage period after 1-MCP treatment. 1-MCP down-regulated the expression levels ofandtranscription factor at the peak of their expressions. However, 1-MCP had little effect on the correlations of thetranscription factor with thegene. 【】 ETH treatment advanced the peak activity of AAT enzyme, the peak expression ofandtranscription factors, down-regulated the expression ofandtranscription factors, and decreased the activity of AAT enzyme and the correlation betweenandtranscription factors. Compared with the control group, 1-MCP treatment inhibited the activity of AAT enzyme, the expression ofgene andtranscription factors in the pre-storage phase, decreased the activity of AAT enzyme and down-regulated the expression levels ofandtranscription factors during the late storage period.

jackfruit; ETH; 1-MCP;gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.21.017

2019-05-15；

2019-08-21

國家自然科學基金青年基金（31401928）、廣東省自然科學基金博士啟動項目（S2013040011544）、廣東海洋大學引進人才科研啟動項目（1312130）、廣東海洋大學碩士學位論文培育項目(201841)、廣東海洋大學配套經(jīng)費項目（C15486，C15491）、廣東海洋大學大學生創(chuàng)新項目（CXXL2014068）

任雪巖，E-mail：xy85580@163.com。通信作者王俊寧，Tel：07592383252；E-mail：wangjunningb@126.com

（責任編輯 趙伶俐）