基于SNP遺傳圖譜對(duì)甘藍(lán)型油菜部分脂肪酸組成性狀的QTL定位

葉桑，崔翠，郜歡歡，雷維，王劉艷，王瑞莉，陳柳依，曲存民，唐章林，李加納，周清元

基于SNP遺傳圖譜對(duì)甘藍(lán)型油菜部分脂肪酸組成性狀的QTL定位

葉桑，崔翠，郜歡歡，雷維，王劉艷，王瑞莉，陳柳依，曲存民，唐章林，李加納，周清元

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715）

【】菜籽油在烹飪、食品加工及工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，因此，根據(jù)生產(chǎn)需要改善菜籽油脂肪酸組分是油菜育種的重要目標(biāo)。通過對(duì)2種環(huán)境下甘藍(lán)型油菜主要脂肪酸組成進(jìn)行QTL定位分析，尋找甘藍(lán)型油菜脂肪酸組分的QTL及影響本群體脂肪酸組分的候選基因。以人工合成甘藍(lán)型油菜10D130和甘藍(lán)型油菜常規(guī)品種中雙11構(gòu)建高世代重組自交系（RIL）為研究材料，分別于2016—2017年和2017—2018年2個(gè)年度在重慶市北碚區(qū)2個(gè)不同的環(huán)境中設(shè)置田間試驗(yàn)，收獲自交種子，采用氣相色譜法3次重復(fù)對(duì)種子的脂肪酸組分進(jìn)行分析。利用油菜6K SNP芯片對(duì)該RIL群體進(jìn)行基因分型，DNA樣品預(yù)處理及芯片處理嚴(yán)格按照Illumina Inc 公司Infinium HD Assay Ultra操作說明進(jìn)行。取最小閾值LOD 2.0利用JoinMap4.0軟件構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜。通過QTL IciMapping V4.1完備區(qū)間作圖法對(duì)油菜主要脂肪酸組成進(jìn)行QTL定位。2種環(huán)境中，兩親本各性狀間差異及RIL群體各性狀在株系間差異均達(dá)到顯著或極顯著水平，且6種脂肪酸含量在2個(gè)環(huán)境中均表現(xiàn)為連續(xù)分布，適合進(jìn)行QTL檢測(cè)。構(gòu)建用于QTL定位的遺傳圖譜包含1 897個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記，覆蓋甘藍(lán)型油菜基因組3 214.19 cM，平均圖距1.69 cM。利用此圖譜，在2個(gè)環(huán)境共檢測(cè)到位于8條染色體上的23個(gè)控制脂肪酸組分QTL位點(diǎn)，與硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、廿碳烯酸和芥酸含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)分別為6、3、4、5、2和3個(gè)，其中在A05、A08和C03染色體上發(fā)現(xiàn)多種脂肪酸含量的QTL“富集區(qū)”。在A05染色體上檢測(cè)到亞油酸和亞麻酸含量重疊的主效QTL，亞油酸與亞麻酸表現(xiàn)加性效應(yīng)相同；在A08和C03上都檢測(cè)到油酸、廿碳烯酸和芥酸含量重疊的主效QTL，油酸與廿碳烯酸及芥酸表現(xiàn)加性效應(yīng)相反。與擬南芥脂肪酸代謝基因進(jìn)行同源性比對(duì)分析，在17個(gè)QTL置信區(qū)間內(nèi)篩選到22個(gè)候選基因，主要通過編碼脂肪酸去飽和酶、全羧化酶合酶、碳鏈延長(zhǎng)酶和參與?；o酶A生物合成等途徑調(diào)控脂質(zhì)的生物合成和代謝。利用甘藍(lán)型油菜6K SNP芯片準(zhǔn)確定位了2種環(huán)境條件脂肪酸組成的QTL位點(diǎn)，篩選到位于A05、A08和C03染色體上多種脂肪酸QTL的“富集區(qū)”，并與擬南芥脂肪酸代謝基因比對(duì)出該群體油菜脂肪酸代謝基因，可作為改善油菜籽脂肪酸組成的重要區(qū)段及候選基因。

甘藍(lán)型油菜；脂肪酸；遺傳圖譜；QTL；候選基因

0 引言

【研究意義】油菜是中國(guó)主要的油料作物，其種植面積和總產(chǎn)量居世界首位[1]，目前，已經(jīng)成為繼水稻、小麥、玉米之后的第四大作物，是中國(guó)的優(yōu)勢(shì)油料作物[2]。菜籽油是中國(guó)主要的食用油之一，其主要脂肪酸組成包括硬脂酸（C18﹕0）、油酸（C18﹕1）、亞油酸（C18﹕2）、亞麻酸（C18﹕3）、廿碳烯酸（C20﹕1）和芥酸（C22﹕1）等。食用油中油酸具有極高的營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)用價(jià)值，高油酸菜籽油不僅有利于人體心血管健康[3]，還因其熱穩(wěn)定性高[4]，利于純化儲(chǔ)存而被用于煎炸行業(yè)[5]以及生產(chǎn)、生活用品的原料[6]。亞油酸是一種必需脂肪酸，可防止動(dòng)脈粥樣硬化，但存在氧化穩(wěn)定性差、儲(chǔ)存時(shí)間短的缺點(diǎn)。亞麻酸屬多烯類不飽和脂肪酸，因存在3個(gè)不飽和鍵而易氧化變質(zhì)，故亞麻酸含量較高的菜籽油不耐儲(chǔ)存[7]。芥酸因其碳鏈較長(zhǎng)，在人體內(nèi)不易被消化吸收，不適用于食品加工[8]，然而芥酸是重要的工業(yè)原料，被廣泛應(yīng)用于眾多工業(yè)領(lǐng)域[7]。因此，根據(jù)生產(chǎn)需要改善油菜脂肪酸的組成成分是油菜育種的重要目標(biāo)，定位油菜脂肪酸組分的QTL和篩選影響脂肪酸組分的候選基因在油菜育種中都具有重要的指導(dǎo)作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究表明，在油菜主要脂肪酸的形成過程中，首先由棕櫚酸在碳鏈延長(zhǎng)酶的作用下合成硬脂酸[9]，硬脂酸在質(zhì)體基質(zhì)中再被硬脂酰-ACP脫氫酶催化形成油酸[10]，而油酸包含2條代謝途徑：其一，油酸在碳鏈延長(zhǎng)酶的作用下合成廿碳烯酸，廿碳烯酸進(jìn)一步延長(zhǎng)碳鏈生成芥酸[11]；其二，油酸在△12減飽和酶作用下生成亞油酸[12]，亞油酸在△15減飽和酶作用下進(jìn)一步減飽和生成亞麻酸[13]。了解主要脂肪酸的代謝途徑是改善油菜脂肪酸組成的前提，通過分子標(biāo)記定位相關(guān)性狀QTL并篩選出候選基因有利于更準(zhǔn)確了解脂肪酸各組分受到影響的遺傳因素。迄今為止，利用分子標(biāo)記技術(shù)的QTL定位分析在油菜相關(guān)性狀包括抗性[14-16]、育性[17-18]和品質(zhì)[19-21]等方面廣泛發(fā)展，為油菜分子的育種改良奠定了基礎(chǔ)。油菜脂肪酸含量具有較高的遺傳力，對(duì)其相關(guān)分子標(biāo)記的確定是改善油菜脂肪酸組成的關(guān)鍵。Burns等[22]利用RFLP分子標(biāo)記進(jìn)行油菜脂肪酸組成的QTL定位，獲得4個(gè)與油酸含量相關(guān)的QTL，其中效應(yīng)較大的QTL位于N3、N8、N18染色體，效應(yīng)較小的位于N11染色體；獲得5個(gè)與亞油酸含量相關(guān)的QTL，效應(yīng)相對(duì)較大QTL位于N8和N14染色體；獲得5個(gè)與亞麻酸含量相關(guān)的QTL，分別位于N6、N7、N18和N11染色體。張潔夫等[23]采用RAPD、SSR和SRAP 3種分子標(biāo)記對(duì)油菜脂肪酸組成進(jìn)行QTL定位，獲得3個(gè)與硬脂酸含量相關(guān)的QTL，分別位于N1、N8和N16染色體；獲得2個(gè)與油酸含量相關(guān)的主效QTL，分別位于N8和N13染色體；獲得3個(gè)與亞油酸含量相關(guān)的QTL，其中2個(gè)位于N8染色體，1個(gè)位于N13染色體；獲得3個(gè)與亞麻酸含量相關(guān)的微效QTL；獲得4個(gè)與廿碳烯酸含量相關(guān)的QTL，分別位于N8、N13和N15染色體；在N8和N13染色體獲得2個(gè)與芥酸含量相關(guān)的主效QTL。Zhao等[24]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜找到了7個(gè)控制油酸含量的QTL，其中，主效QTL位于N18染色體；找到7個(gè)控制亞油酸含量的QTL，其中主效QTL位于N9染色體；并在N14染色體找到1個(gè)控制亞麻酸含量的QTL。與上述分子標(biāo)記技術(shù)相比，SNP標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣和規(guī)模化等優(yōu)點(diǎn)，已成為大家認(rèn)可的第三代遺傳標(biāo)記，近幾年被廣泛應(yīng)用于油菜產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀的分子標(biāo)記輔助育種及遺傳定位等諸多領(lǐng)域。例如，Liu等[25]利用油菜SNP芯片技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜，對(duì)油菜籽木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等性狀進(jìn)行QTL定位。Shen等[26]采用SNP分子標(biāo)記技術(shù)定位了17個(gè)油菜分枝角度QTL，并在QTL區(qū)間獲得27個(gè)候選基因。Qu等[27]利用520份油菜資源群體對(duì)油菜籽脂肪酸組成進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，確定了62個(gè)與7種脂肪酸組成顯著相關(guān)的基因組區(qū)域，并鑒定了24個(gè)參與脂肪酸生物合成的功能候選基因的同源基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對(duì)油菜脂肪酸含量的定位研究主要是利用SSR、AFLP、RFLP和SRAP等分子標(biāo)記，存在標(biāo)記的多位點(diǎn)現(xiàn)象，給不同連鎖圖譜之間QTL位點(diǎn)的比較分析帶來困難。另外，前人在QTL作圖方法上大多采用區(qū)間作圖法和復(fù)合區(qū)間作圖法，致使QTL效應(yīng)可能會(huì)被側(cè)連標(biāo)記區(qū)間之外的標(biāo)記變量所吸收[28]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用油菜6K SNP芯片構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜，通過完備區(qū)間作圖法對(duì)油菜主要脂肪酸組成進(jìn)行QTL定位。結(jié)合2年的表型鑒定，發(fā)掘在不同環(huán)境條件下穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，并利用甘藍(lán)型油菜基因組序列，與擬南芥脂肪酸相關(guān)代謝基因進(jìn)行同源性分析，篩選可能的候選基因，旨在探討油菜主要脂肪酸之間的內(nèi)在聯(lián)系，為改善油菜脂肪酸組成進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇、克隆相關(guān)候選基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組自交系群體的母本為人工合成甘藍(lán)型油菜新品系10D130，其芥酸含量50%左右，父本為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的天然甘藍(lán)型油菜常規(guī)品種中雙11號(hào)（簡(jiǎn)稱ZS11），其芥酸含量＜1%。兩親本雜交F2通過單粒法連續(xù)自交7代，構(gòu)建重組自交系群體，以其中的186個(gè)材料進(jìn)行SNP標(biāo)記分析，構(gòu)建高密度SNP遺傳連鎖圖譜。所有試驗(yàn)材料均由西南大學(xué)重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 田間試驗(yàn)

2016—2017年和2017—2018年2個(gè)年度，在重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)油菜實(shí)驗(yàn)基地種植重組自交系群體及其親本，2個(gè)環(huán)境分別記為17Cq和18Cq。田間播種采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)5行，每行10株。田間管理遵循常規(guī)生產(chǎn)方式，在油菜初花期逐株套袋自交，種子完全成熟后每家系收取5株正常植株的種子，自然風(fēng)干后保存。

1.3 脂肪酸組成的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[29]的方法，利用氣相色譜儀GC-2010（Shimazu，JAP）測(cè)定2個(gè)環(huán)境下重組自交系群體種子中硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、廿碳烯酸及芥酸的含量，每份材料重復(fù)測(cè)定3株，取其平均值。

1.4 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL分析

參考劉列釗等[30]方法，分別從每個(gè)株系的5個(gè)幼嫩植株葉片取混合樣0.15 g，利用DNA提取試劑盒DP321-03（天根，中國(guó)北京）提取DNA并稀釋至50 ng·μL-1用于SNP標(biāo)記分析。嚴(yán)格按照Infinium HD Assay Ultra操作說明書（Illumina Inc 公司）進(jìn)行DNA樣品的預(yù)處理（等位擴(kuò)增、片段化及富集）、與芯片雜交、洗滌、安裝流動(dòng)室、單堿基延伸、染色及包埋。芯片準(zhǔn)備好后運(yùn)用Illumina HiScan掃描儀的iScan Control Software軟件掃描，然后利用GenomeStudio genotyping software v2011軟件分析掃描結(jié)果，獲取各個(gè)樣本的SNP基因型數(shù)據(jù)，并為獲得的SNP標(biāo)記命名，命名方法以S-95505568為例，S表示SNP，95505568代表GenomeStudio genotyping software生成的相應(yīng)SNP位點(diǎn)索引號(hào)。

連鎖圖譜的構(gòu)建采用JoinMap4.0軟件[31]，選用Kosambi[32]函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為圖距單位（centiMorgan，cM），取最小閾值LOD2.0對(duì)所有標(biāo)記進(jìn)行分組，每個(gè)染色體上標(biāo)記順序通過兩兩標(biāo)記之間最小重組頻率計(jì)算，構(gòu)建用于QTL定位的遺傳連鎖圖譜。

采用軟件QTL IciMapping V4.1[33]完備區(qū)間作圖（inclusive composite interval mapping，ICIM）法，進(jìn)行2個(gè)環(huán)境下硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、廿碳烯酸及芥酸含量的QTL定位和檢測(cè)。進(jìn)行ICIM分析時(shí)，選用1 cM的步長(zhǎng)（walking speed），作1 000次排列檢驗(yàn)和顯著水平0.01確定LOD臨界值。軟件運(yùn)行結(jié)果可同時(shí)給出性狀QTL的加性效應(yīng)和表型貢獻(xiàn)率。QTL命名時(shí)以q加上性狀的英文縮寫再加上染色體編號(hào)及QTL序號(hào)表示，字體斜體，如代表亞油酸含量位于C03染色體上的第一個(gè)QTL。同一性狀在染色體相同的位置檢測(cè)到重復(fù)的QTL，且加性效應(yīng)方向一致，認(rèn)為是同一QTL。

1.5 候選基因篩選

為篩選出與脂肪酸組成相關(guān)的候選基因，首先將檢測(cè)到的QTL置信區(qū)間在甘藍(lán)型油菜基因組上對(duì)應(yīng)的序列查詢到，然后與Botella等[34]、Qu等[27]搜索出的擬南芥脂肪酸代謝相關(guān)基因進(jìn)行BlastN比對(duì)，將E值設(shè)定為E-20，最后篩選出每個(gè)QTL置信區(qū)間內(nèi)匹配E值小于閾值的候選基因。

2 結(jié)果

2.1 重組自交系群體脂肪酸含量的分析

兩親本和RIL群體的表型分析見表1。RIL群體的表型在2個(gè)環(huán)境中表現(xiàn)一致：6個(gè)性狀的均值都介于兩親本之間，最大值和最小值都超過親本值，存在明顯的超親分離現(xiàn)象。另外，兩親本各性狀間差異及RIL群體各性狀在株系間差異都達(dá)到顯著或極顯著水平，結(jié)合變異系數(shù)值反映出這幾個(gè)性狀在該群體中具有較廣泛的遺傳變異。由性狀頻率分布圖（圖1）可知，硬脂酸、亞油酸和亞麻酸呈現(xiàn)偏態(tài)分布的特征，油酸、廿碳烯酸和芥酸含量則表現(xiàn)為明顯的多峰分布，結(jié)果表明，6種脂肪酸含量在2個(gè)環(huán)境中均表現(xiàn)為連續(xù)分布，適合進(jìn)行QTL檢測(cè)。

由表2可知，在2個(gè)環(huán)境下油酸含量與硬脂酸及亞油酸含量均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)（＜0.01），與廿碳烯酸及芥酸含量均表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與亞麻酸含量相關(guān)性不強(qiáng)。芥酸含量與廿碳烯酸含量下2個(gè)親本的脂肪酸含量在2個(gè)環(huán)境中均表現(xiàn)極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.56和0.64；與亞油酸含量在2個(gè)環(huán)境中均表現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.52和-0.54。結(jié)果表明，油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的途徑受到芥酸途徑的掣肘，即油酸和亞油酸的含量受芥酸含量的變化影響較大。而亞麻酸受油酸和芥酸變化的影響較小，在遺傳上具有相對(duì)獨(dú)立的穩(wěn)定性。

表1 2個(gè)環(huán)境下油菜主要脂肪酸含量的變化

a、b和A、B分別代表在0.05和0.01水平上差異顯著，*和**分別代表在0.05和0.01水平上差異顯著。C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C22:1和C22:2分別代表硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、廿碳烯酸和芥酸。下同

a,bandA,Bindicate significance at＜0.05 and＜0.01, * and ** indicate significance at＜0.05 and＜0.01. C18:0, C18:1, C18:2, C18:3, C22:1 and C22:2 represent stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, eicosenoic acid and erucic acid, respectively. The same as below

P1、P2和P’1、P’2分別標(biāo)出了17Cq和18Cq環(huán)境

P1, P2and P'1, P'2indicated the fatty acid content of two parents under 17Cq and 18Cq environment respectively

圖1 RIL群體硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、廿碳烯酸及芥酸含量的頻率分布

Fig. 1 Frequency distribution of stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, eicosenoic acid and erucic acid content from the RIL population in two different environments

表2 2個(gè)環(huán)境下主要脂肪酸含量相關(guān)分析

右上部代表17Cq環(huán)境，左下部代表18Cq環(huán)境

The upper right represents the 17Cq environment and the lower left represents the 18Cq environment

2.2 遺傳連鎖圖譜

利用包含5 058個(gè)標(biāo)記的6K油菜芯片對(duì)186個(gè)RIL材料進(jìn)行基因型鑒定，從中篩選出1 897個(gè)高質(zhì)量多態(tài)性的SNP標(biāo)記，約占37.5%，基于這些標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。獲得用于QTL定位的圖譜覆蓋甘藍(lán)型油菜基因組3 214.19 cM，平均圖距為1.69 cM。每條染色體長(zhǎng)度在86.51—298.72 cM，平均長(zhǎng)度為169.17 cM。染色體標(biāo)記數(shù)目在24—153，平均數(shù)目為99.84個(gè)。但是從標(biāo)記分布來看，各染色體分布不均，其中染色體A03、C03和C04上標(biāo)記分布較多，分別為139、147和153個(gè)；而染色體C05、C08和C09上的標(biāo)記數(shù)目較少，分別只有48、26和24個(gè)。此外各染色體標(biāo)記密度也有較大差異，C04密度最大，平均間距僅1.10 cM，而密度最小的C08平均間距達(dá)6.13 cM。

2.3 主要脂肪酸含量的QTL分析

2.3.1 硬脂酸含量的QTL 在2個(gè)環(huán)境中，硬脂酸含量共定位到6個(gè)QTL，解釋表型變異5.08%—25.49%，其中主效QTL位點(diǎn)位于A08和C03上。C03上的主效位點(diǎn)在2個(gè)環(huán)境中能被重復(fù)檢測(cè)到，分別解釋表型變異的11.59%和9.12%；在A08上的2個(gè)QTL位點(diǎn)分別解釋硬脂酸含量表型變異的14.00%和25.49%。且A08和C03上的QTL位點(diǎn)在2個(gè)環(huán)境中的加性效應(yīng)均小于0（表3和圖2），即加性效應(yīng)均來源于親本ZS11。

2.3.2 油酸含量的QTL 在2個(gè)環(huán)境中共檢測(cè)到3個(gè)與油酸含量相關(guān)的 QTL，且3個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)環(huán)境中均能被重復(fù)檢測(cè)到，其中位于A08和C03染色體上的是主效位點(diǎn)，可解釋油酸含量表型變異的28.28%—43.68%。在2個(gè)環(huán)境中，位于A05上的QTL位點(diǎn)加性效應(yīng)分別為3.81和3.91，而A08和C03染色體上主效位點(diǎn)的效應(yīng)值在-11.42—-8.66（表3和圖2），即前者的加性效應(yīng)來源于親本10D130，后兩者的加性效應(yīng)則來自親本ZS11。

2.3.3 亞油酸含量的QTL 在2個(gè)環(huán)境中，亞油酸含量共檢測(cè)到4個(gè)QTL，除了C03染色體上的以外，其余3個(gè)QTL均能在2個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到。其中主效QTL位于A05和C03上，可解釋亞油酸含量表型變異的12.56%—25.25%；A08染色體上重復(fù)檢測(cè)到的QTL位點(diǎn)在2個(gè)環(huán)境中的遺傳貢獻(xiàn)率分別為8.91%和10.49%。同時(shí)，在2個(gè)環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到的3個(gè)QTL位點(diǎn)的效應(yīng)值在-2.37—-1.18（表3和圖2），即加性效應(yīng)均來自親本ZS11。

2.3.4 芥酸含量的QTL 在2個(gè)環(huán)境中共定位到3個(gè)與芥酸含量相關(guān)的QTL，其中位于A08和C03上的主效QTL位點(diǎn)能夠在2個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到，可解釋表型變異16.45%—67.26%。芥酸含量的3個(gè)QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)均為正值，加性效應(yīng)均來源于親本10D130，其中，的效應(yīng)值最大，為17.53（表3和圖2），屬主基因座位。其他主要脂肪酸的QTL定位結(jié)果見表3和圖2。

2.4 主要脂肪酸代謝候選基因篩選

將23個(gè)QTL置信區(qū)間序列與擬南芥脂肪酸代謝基因進(jìn)行比對(duì)，分別在A01、A02、A05、A08、A09、A10和C03染色體上的17個(gè)QTL區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到22個(gè)候選基因，匹配E值介于0—4E-17（表4）。位于A01染色體上的基因和分別與擬南芥基因和同源，參與輔酶A的生物合成。A02染色體上的基因、和分別與擬南芥基因、和同源，分別編碼長(zhǎng)鏈?；o酶A合成酶、β-酮酰輔酶A還原酶和全羧化酶合酶。A05染色體上的基因、、、和分別與擬南芥基因、、、和同源，第一個(gè)編碼脂肪酸脫氫酶，后4個(gè)參與脂質(zhì)代謝過程。在A09染色體上的基因與擬南芥基因同源，編碼脂肪酸去飽和酶。A10染色體上的基因和分別與擬南芥基因和同源，前者是丙酮酸激酶家族蛋白成員，后者是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員。A08和C03染色體上存在多個(gè)同源基因，其中和與擬南芥基因同源，和與擬南芥基因同源，兩者同屬3-酮酰輔酶A合成酶家族；和與擬南芥基因同源，編碼一種脂肪酰輔酶A還原酶。

3 討論

3.1 QTL定位結(jié)果的比較分析

油菜主要脂肪酸QTL定位研究前人已有報(bào)道，本研究的部分結(jié)果與已有研究結(jié)果一致性較高，但也發(fā)現(xiàn)了一些新的QTL區(qū)域。例如，本研究通過完備區(qū)間作圖法發(fā)現(xiàn)了控制芥酸含量的3個(gè)QTL，其中位于A08和C03染色體上的2個(gè)主效QTL在2個(gè)環(huán)境下被重復(fù)檢測(cè)到，第3個(gè)微效QTL也位于A08染色體，與前人將控制芥酸含量的QTL主要集中在A08和C03上的結(jié)果一致[23,30,35-36]。油酸的遺傳比較復(fù)雜，本研究在2個(gè)環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到位于A08和C03染色體上油酸含量的2個(gè)主效QTL，和芥酸的主效QTL重疊，加性效應(yīng)相反，這與劉列釗等[30]的研究結(jié)果相同。不同的是，本研究親本并非高油酸材料，卻在2個(gè)環(huán)境中重復(fù)定位到位于A05染色體上油酸含量的1個(gè)微效QTL，該位點(diǎn)同時(shí)還是亞油酸的主效QTL位點(diǎn)，這在前人研究中未發(fā)現(xiàn)。本研究在該位點(diǎn)上篩選到候選基因，同時(shí)檢測(cè)到該群體（RIL）中的4個(gè)高油酸材料的第722位堿基A突變成T導(dǎo)致酪氨酸變成苯丙氨酸，從而影響了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致油酸含量提高，這與張宏軍等[37]的研究結(jié)果一致。而親本ZS11的正常，結(jié)合A05染色體上QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)來源于親本10D130，猜測(cè)的變異來自親本10D130。亞麻酸含量是典型的數(shù)量性狀，易受環(huán)境影響[30]。在17Cq環(huán)境中，亞麻酸含量檢測(cè)到1個(gè)位于C07染色體上的主效QTL，解釋表型變異的11.66%，而在18Cq環(huán)境中，檢測(cè)到一個(gè)主效QTL位于A05染色體，解釋亞麻酸含量表型變異的23.66%，這與前人主要將亞麻酸含量主效QTL定位在A04和C04染色體不同[12,24,38]，可能的原因是受環(huán)境因素影響較大。本研究采用完備區(qū)間作圖法對(duì)甘藍(lán)型油菜RIL群體的一系列油菜籽脂肪酸含量進(jìn)行QTL定位，一方面進(jìn)一步驗(yàn)證了已有研究的可靠性，另一方面也說明這些能夠被多次重復(fù)定位的主效區(qū)段和新發(fā)現(xiàn)的基因組區(qū)段均是控制油菜籽主要脂肪酸含量的重要區(qū)域，對(duì)剖析油菜籽脂肪酸含量的遺傳具有重要意義。

表3 油菜主要脂肪酸含量在2個(gè)環(huán)境中的QTL位點(diǎn)

1)：標(biāo)記在遺傳連鎖圖譜上的連鎖位置

1): linkage location of markers on the genetic linkage map

表4 在甘藍(lán)型油菜脂肪酸含量QTL置信區(qū)間比對(duì)擬南芥相關(guān)基因獲得的候選基因

3.2 主要脂肪酸含量QTL之間的相關(guān)性

研究主要對(duì)甘藍(lán)型油菜主要脂肪酸，包括硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、廿碳烯酸及芥酸含量進(jìn)行QTL定位分析。結(jié)果表明，控制這些脂肪酸含量的QTL之間存在明顯的相關(guān)性，主要表現(xiàn)為A05、A08和C03染色體上出現(xiàn)QTL的“富集區(qū)”。在A05染色體的相同位置同時(shí)存在硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸4種脂肪酸的QTL，其中對(duì)于亞油酸和亞麻酸是主效QTL，且加性效應(yīng)方向一致，可解釋二者在2個(gè)環(huán)境中所表現(xiàn)的0.45和0.49的極顯著正相關(guān)性。在A08和C03染色體上相同的置信區(qū)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)出油酸、廿碳烯酸和芥酸的主效QTL位點(diǎn)，即控制油酸含量的主效QTL同時(shí)也是控制廿碳烯酸和芥酸含量的主效QTL，油酸的2個(gè)主效位點(diǎn)加性效應(yīng)值都為負(fù)，而廿碳烯酸和芥酸在此位點(diǎn)上的加性效應(yīng)則表現(xiàn)為正值，充分解釋了油酸和廿碳烯酸含量之間、油酸和芥酸含量之間在2個(gè)環(huán)境中都表現(xiàn)的極顯著負(fù)相關(guān)性以及廿碳烯酸和芥酸含量在2個(gè)環(huán)境中的極顯著正相關(guān)性。

根據(jù)表型相關(guān)性分析和QTL相關(guān)性分析認(rèn)為，油酸的2條代謝途徑并不均衡，其“加碳”途徑比“脫氫”途徑更具優(yōu)勢(shì)。一方面表現(xiàn)在A08和C03上芥酸的2個(gè)主效QTL對(duì)于油酸也是主效位點(diǎn)，可解釋油酸表型變異的28.28%—43.68%，而A05上亞油酸的主效QTL對(duì)于油酸是微效位點(diǎn)，只解釋油酸表型變異的3.8%—5.7%；另一方面，A08染色體上芥酸的主效QTL同時(shí)也是亞油酸的QTL，可解釋亞油酸表型變異的8.91%，而亞油酸在A05上的主效QTL并不能解釋芥酸含量的表型變異，這就表明，“加碳”途徑制約著亞油酸的含量，而“脫氫”途徑則對(duì)芥酸的含量影響不大。在育種工作中，對(duì)亞油酸含量的提高，需要阻斷油酸向芥酸轉(zhuǎn)化的途徑；而高油酸的獲得，則需要對(duì)2條代謝途徑同時(shí)進(jìn)行抑制。所以針對(duì)這些區(qū)段的深入研究和挖掘?yàn)楦纳朴筒酥舅峤M成奠定基礎(chǔ)。

3.3 脂肪酸代謝候選基因

本研究在油菜籽脂肪酸組分QTL置信區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)22個(gè)脂肪酸代謝相關(guān)基因。這些候選基因主要集中在A05、A08和C03染色體上，其中位于A05染色體上的基因（）編碼脂肪酸脫氫酶，是調(diào)控多不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵基因[39]。其中坐落于A08和C03染色體上的同源基因（和）是參與長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵基因，已被很多學(xué)者研究報(bào)道[40-42]，這表明我們的QTL定位是可靠的。在A08和C03染色體上篩選的另外2個(gè)同源基因（和）和（和），通過各自編碼一種醇形成的脂肪酰輔酶A還原酶參與飽和脂肪酸的生物合成[43-44]。位于A01染色體上的基因（）和（）參與輔酶A的生物合成，有研究[45]表明，輔酶A可與醋酸鹽結(jié)合為脂肪酸從頭合成的前體物質(zhì)乙酰輔酶A。在A02染色體上的候選基因與擬南芥基因同源，已被證實(shí)通過催化脂肪酸、ATP和輔酶A形成酰基輔酶A，參與擬南芥籽油的生物合成[46]。此外，本研究還在QTL置信區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)許多未知功能基因，可能存在油菜特有的脂肪酸代謝功能基因，有待進(jìn)一步挖掘。

4 結(jié)論

在2個(gè)環(huán)境中共檢測(cè)到位于A01、A02、A05、A08、A09、A10、C03和C07染色體上的23個(gè)脂肪酸組分QTL位點(diǎn)，與硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、廿碳烯酸和芥酸含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)分別為6、3、4、5、2和3個(gè)，其中在A05、A08和C03染色體上發(fā)現(xiàn)多種脂肪酸含量的QTL“富集區(qū)”，可作為改善油菜籽脂肪酸組成的重要區(qū)段。通過與擬南芥脂肪酸代謝基因的比對(duì)分析，在QTL置信區(qū)間內(nèi)篩選到22個(gè)脂肪酸代謝相關(guān)候選基因。

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QTL Identification for Fatty Acid Content inUsing the High Density SNP Genetic Map

YE Sang, CUI Cui, GAO HuanHuan, LEI Wei, WANG LiuYan, WANG RuiLi, CHEN LiuYi, QU CunMin, TANG ZhangLin, LI JiaNa, ZHOU QingYuan

(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715)

【】Rapeseed oil is widely used in cooking, food processing and industrial production. Therefore, improving the fatty acid composition of rapeseed oil according to the specific production objective is an important goal of rapeseed breeding. In this study, QTL mapping of main fatty acid composition inunder two environments was conducted, which was designed to search for the QTL and related candidate genes of fatty acid components in.【】The high generation recombinant inbred lines (RILs) were used as experiment materials, which were derived from synthetic 10D130 and conventional variety Zhongshuang11, and field experiments were conducted in 2016-2017 and 2017-2018 with two different environments in Beibei District of Chongqing City, respectively. After self-pollinated seeds were harvested each year, fatty acid components of seeds were measured by GC with three technical repeats. Then, the RIL population genotype was analyzed with the rapeseed 6K SNP chip array. The DNA preparation and the chip preparation were processed strictly according to Infinium HD Assay Ultra manual of Illumina Inc. The SNP linkage map was constructed by using JoinMap 4.0 program with minimum LOD 2.0. QTL mapping of main fatty acid composition was conducted by composite interval mapping using software Windows QTL IciMapping V4.1.【】In the two environments, the differences of parents’ traits and RILs population’s traits reached significant or extremely significant levels, and the contents of six fatty acids showed continuous distribution, which were suitable for the detection of QTLs. The reference SNP genetic map contains 1 897 polymorphic SNP markers, covering 3 214.19 cM ofgenome with an average map distance of 1.69 cM. Twenty-three QTLs loci of fatty acid components on 8 chromosomes were detected in two environments. The QTLs loci related to stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, eicosapentaenoic acid and erucic acid contents were 6, 3, 4, 5, 2 and 3, respectively. And the “enrichment regions” of multiple fatty acid contents were found on chromosomes A05, A08 and C03. Meantime, the main QTL with overlapping linoleic acid and linolenic acid content was detected on A05 chromosome, showing the same additive effect. And the main effect QTLs, oleic acid with overlapping contents of eicosenic acid and erucic acid were detected on A08 and C03, which was opposite to the additive effect of eicosenic acid and erucic acid. Twenty-two candidate genes of fatty acid metabolic were found underlying confidence intervals of seventeen QTLs by comparing with homologous genes in. These genes regulate lipid biosynthesis and metabolism through encoding fatty acid desaturase, total carboxylase synthase, carbon chain lengthening enzyme and participating in acyl coenzyme A biosynthesis. 【】The fatty acid composition QTL under two environments were mapped accurately with the 6K SNP chip of rapeseed, and the “enrichment regions” of multiple fatty acid QTLs on chromosomes A05, A08 and C03 were screened. Compared withfatty acid metabolic genes, candidate genes for fatty acid metabolism in this population were detected, which could be used for improving fatty acid composition in rapeseed.

; fatty acid; genetic map; QTL; candidate gene

2019-05-28；

2019-07-11

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.21.002

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0100500）、農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-12）、重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展（cstc2019jscx-msxmX0383）

葉桑，Tel：13068300612；E-mail：837276825@qq.com。崔翠，Tel：13883787860；E-mail：cuigreeny@163.com。葉桑和崔翠為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者周清元，Tel：13883388890；E-mail：zhouqy2005@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）