楊軍 何宏 鐘興武
過敏性結(jié)膜炎是一類常見眼科疾病,主要由Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)引起,常見癥狀為眼癢,并伴有結(jié)膜充血、水腫、濾泡增生等體征[1-3]。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、病程及預(yù)后的差異,大體可分為春季過敏性角結(jié)膜炎、常年型過敏性結(jié)膜炎、季節(jié)性過敏性結(jié)膜炎、巨乳頭性結(jié)膜炎以及特應(yīng)性角結(jié)膜炎,共5種類型[4-6]。M細(xì)胞是一種特殊細(xì)胞,位于淋巴細(xì)胞圓丘部的上皮中,具有抗原吞噬和穿胞運輸功能,是人體黏膜免疫體系的重要組成部分,在免疫反應(yīng)過程中起到重要作用,其在腸道中的作用也受到了深入研究[7-11]。近年來,M細(xì)胞在過敏性結(jié)膜炎中的作用逐漸引起了人們的重視。本研究通過構(gòu)建小鼠過敏性結(jié)膜炎模型,探討M細(xì)胞增殖與白細(xì)胞介素4(interleukin 4,IL-4)-JAK1-STAT6信號通路的聯(lián)系,為過敏性結(jié)膜炎的臨床治療提供參考。
1.1 實驗動物選取SPF級Barb/c小鼠18只(購自廣東省實驗動物中心),5~6周齡,雌性,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本研究遵循《實驗動管理條例物》(2017修訂版)的規(guī)定。
1.2 主要試劑及儀器鹽酸奧洛他定滴眼液[愛爾康(中國)眼科產(chǎn)品有限公司],卵清蛋白(OVA)和Al(OH)3(美國Sigma公司),IL-4、JAK1、STAT6 試劑盒(美國R&D Systems),RT-PCR 試劑盒(日本TAKARA公司)。實驗用主要儀器:全自動酶標(biāo)儀(美國Rayto公司)。山羊抗兔IgG、兔抗鼠AnnexinA5(英國Abcam公司)。
1.3 造模與分組將18只小鼠隨機分為空白對照組、模型組、治療組,每組6只。空白對照組正常飼養(yǎng);模型組及治療組分別于開始實驗的第1天、第7天,腹腔注射含OVA 100 μg及Al(OH)35 mg的混合液200 μL,進行免疫;第8天至第21天,每眼每天滴加含OVA 100 μg的生理鹽水,加強免疫;第24天,每眼滴加含OVA 200 μg的生理鹽水,進行激發(fā)。治療組,第25天至第31天,每眼滴加鹽酸奧洛他定滴眼液,每天2次,每次1滴;模型組滴加等量生理鹽水。實驗進行至第33天,眼球取血,處死小鼠,收集血液,室溫靜置20 min,3000 r·min-1離心15 min,取血清,-80 ℃保存?zhèn)溆?;取眼瞼,左眼瞼置于40 g·L-1多聚甲醛溶液,-20 ℃保存?zhèn)溆?;右眼瞼置于-80 ℃保存。
1.4 實驗方法
1.4.1 免疫熒光法檢測各組小鼠結(jié)膜M細(xì)胞數(shù)變化情況以Annexin A5為標(biāo)志物檢測眼瞼結(jié)膜M細(xì)胞數(shù)變化。取材通過PFA(0.01 mol·L-1PBS,pH 7.4)固定,經(jīng)乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,不銹鋼模具包埋成組織塊。切片,將厚度3 μm的組織切片覆于經(jīng)多聚賴氨酸覆膜的載玻片上,65 ℃烘烤2 h;二甲苯脫蠟,酒精梯度水化,枸櫞酸修復(fù),30 g·L-1牛血清白蛋白室溫封閉30 min,一抗(兔抗鼠Annexin A5)4 ℃孵育過夜;洗滌,二抗(羊抗兔IgG)避光室溫孵育50 min;DAPI復(fù)染細(xì)胞核,封片,鏡檢。
1.4.2 ELISA檢測各組小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6含量采用ELISA法測定各組小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6含量,實驗步驟按試劑盒說明書進行。
1.4.3 RT-PCR檢測眼瞼組織中JAK1、STAT6 mRNA相對表達量將眼瞼組織研磨破碎,用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA并檢測其濃度,各組以等量總RNA為模板,進行逆轉(zhuǎn)錄cDNA后,按照RT-PCR試劑盒(RR420A)SYBR Green法的步驟進行擴增,以β-actin作為內(nèi)參,引物序列如表1所示,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,擴增40個循環(huán),每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。擴增結(jié)束后,統(tǒng)計各個基因的Ct值,采用2-△△Ct法計算各個基因的相對表達量。
表1 RT-PCR引物序列
1.4.4 Western blot法檢測眼瞼組織中JAK1、STAT6蛋白相對表達量將眼瞼組織研磨,提取總蛋白,以β-actin為內(nèi)參,BCA法定量檢測蛋白濃度,每孔上樣20 μg。SDS-PAGE電泳,80 V,20 min;120 V,60 min。轉(zhuǎn)膜,100 V,40 min。50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗孵育過夜,洗膜3次;二抗室溫孵育2 h,洗膜3次,加ECL處理,暗室X光膠片曝光。
2.1 各組小鼠結(jié)膜M細(xì)胞數(shù)變化情況眼瞼結(jié)膜組織免疫熒光檢測結(jié)果顯示,模型組標(biāo)本中M細(xì)胞陽性率遠(yuǎn)高于空白對照組(P<0.05);治療組M細(xì)胞陽性率有所下降,低于模型組(P<0.05),但仍高于空白對照組(P<0.05);推測過敏性結(jié)膜炎病程與M細(xì)胞陽性率升高有關(guān),見圖1。
圖1 各組小鼠結(jié)膜M細(xì)胞染色情況
2.2 各組小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6含量ELISA檢測結(jié)果顯示,模型組血清中IL-4、JAK1、STAT6含量遠(yuǎn)高于空白對照組(均為P<0.05);治療組IL-4、JAK1、STAT6含量均較模型組顯著下降(均為P<0.05);治療組血清中IL-4、JAK1、STAT6含量均稍高于空白對照組(均為P<0.05)。推測過敏性結(jié)膜炎發(fā)病過程中伴隨血清中IL-4、JAK1、STAT6含量變化。見表2。
表2 各組小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6的含量
注:與空白對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05
2.3 各組小鼠眼瞼組織中JAK1、STAT6 mRNA相對表達量眼瞼組織RT-PCR檢測結(jié)果顯示,模型組JAK1、STAT6 mRNA相對表達量均遠(yuǎn)高于空白對照組(均為P<0.05);治療組JAK1、STAT6 mRNA相對表達量較模型組均顯著下降(均為P<0.05);治療組眼瞼組織中JAK1、STAT6 mRNA相對表達量與空白對照組相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。推測過敏性結(jié)膜炎發(fā)病過程中伴隨眼瞼組織中JAK1、STAT6 mRNA含量變化。見表3。
表3 各組小鼠眼瞼組織中JAK1、STAT6 mRNA相對表達量
注:與空白對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05
2.4 各組小鼠眼瞼組織中JAK1、STAT6蛋白相對表達量Western blot檢測結(jié)果顯示,模型組眼瞼組織中JAK1、STAT6蛋白相對表達量均遠(yuǎn)高于空白對照組(均為P<0.05);治療組JAK1、STAT6蛋白相對表達量較模型組均顯著下降(均為P<0.05);治療組眼瞼組織中JAK1、STAT6蛋白相對表達量與空白對照組相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。推測過敏性結(jié)膜炎發(fā)病過程中眼瞼組織JAK1、STAT6蛋白相對表達量發(fā)生變化。見表4和圖2。
表4 各組小鼠眼瞼組織中JAK1、STAT6蛋白相對表達量
注:與空白對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05
圖2 Western blot法檢測各組小鼠眼瞼組織中JAK1、STAT6蛋白相對表達量
M細(xì)胞是人體黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分,結(jié)膜M細(xì)胞具有典型的形態(tài)學(xué)特點和抗原吞噬和穿胞運輸功能。研究發(fā)現(xiàn)[1,5],特異性抗原疫苗可以通過結(jié)膜給藥,利用結(jié)膜M細(xì)胞特殊的抗原吞噬和傳遞功能為疫苗療法提供新的更安全有效的給藥策略。過敏性結(jié)膜炎發(fā)病率高、難以根治,目前治療手段多集中于局部施加藥物抑制炎癥因子釋放。奧洛他定滴眼液具有雙效作用(抗組胺+穩(wěn)定肥大細(xì)胞),常用于治療過敏性結(jié)膜炎,因此,本研究以鹽酸奧洛他定滴眼液作為治療組用藥[12-13]。
國內(nèi)外研究表明,IL-4、JAK1及STAT6表達異常可引起癌癥、腫瘤、過敏等多種疾病[14-16]。本研究通過構(gòu)建小鼠過敏性結(jié)膜炎模型發(fā)現(xiàn),過敏性結(jié)膜炎發(fā)病過程中M細(xì)胞數(shù)增加,施加藥物處理后M細(xì)胞數(shù)明顯減少,提示M細(xì)胞的增殖過程與過敏性結(jié)膜炎發(fā)病過程相關(guān)。本實驗結(jié)果表明,在不同處理組中IL-4、JAK1及STAT6表達存在差異,模型組異常高表達,治療組與空白對照組差異不明顯,推測IL-4、JAK1及STAT6異常激活可能導(dǎo)致過敏性結(jié)膜炎的發(fā)生。綜合結(jié)膜M細(xì)胞數(shù)變化,推測過敏性結(jié)膜炎發(fā)病過程中M細(xì)胞增殖可能與IL-4-JAK1-STAT6信號通路異常激活有關(guān)。