甘草甜素對(duì)角膜上皮損傷愈合中炎癥反應(yīng)的抑制作用△

周永瑩 孟凡蘭 王婷 王玉川 應(yīng)銘 李軒

角膜是眼屈光成像中的重要組成部分，由于直接暴露在外界環(huán)境中，因此角膜容易受到擦傷、感染、燒傷等各種因素的損害。在角膜上皮損傷愈合過(guò)程中，壞死的細(xì)胞會(huì)釋放各種內(nèi)源性因子——警報(bào)素，它可以趨化炎癥細(xì)胞迅速遷移進(jìn)入受損的組織，進(jìn)而產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致不良后果，如基質(zhì)纖維化、角膜潰瘍等[1-3]。HMGB1作為已知的警報(bào)素之一，已被證實(shí)在角膜炎、葡萄膜炎、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜變性疾病中可作為炎癥因子加重炎癥反應(yīng)，而抑制HMGB1的表達(dá)有望成為新的治療手段[4-7]。目前，HMGB1在角膜上皮損傷愈合中的研究尚未開展。本研究探討HMGB1抑制劑甘草甜素對(duì)角膜上皮損傷愈合中炎癥反應(yīng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器取SPF級(jí)健康8周齡的雄性C57BL/6J小鼠60只，體質(zhì)量(20.00±1.25)g，購(gòu)自協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所。甘草甜素(日本Sigma公司)，ALGERBRUSHⅡ去角膜上皮刀(美國(guó)AlloyMedical公司)，左氧氟沙星滴眼液(日本參天制藥有限公司)，鹽酸丙美卡因滴眼液(比利時(shí)Alcon公司)，抗白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)β抗體(英國(guó)Abcam公司)，髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗體試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?，眼科手術(shù)顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只C57BL/6J小鼠分成治療組和對(duì)照組，每組各30只，兩組小鼠右眼建立角膜上皮損傷模型，左眼不做處理。治療組和對(duì)照組在造模前1 d分別腹腔注射100 μL的2 g·L-1甘草甜素溶液或PBS，造模后每間隔6 h用5 μL的甘草甜素溶液或PBS滴眼，連續(xù)滴眼3 d。本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.2.2 角膜上皮損傷模型的建立兩組小鼠按照10 mL·kg-1標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射50 g·L-1水合氯醛進(jìn)行麻醉，用鹽酸丙美卡因滴眼液對(duì)小鼠右眼行角膜表面麻醉；將直徑為2 mm的角膜環(huán)鉆置于角膜正中央后微旋一周形成壓痕；接著使用已消毒的ALGERBRUSH Ⅱ去角膜上皮刀刮除直徑為2 mm范圍的角膜上皮，同時(shí)保持角膜緣區(qū)上皮完整。術(shù)后使用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊并用左氧氟沙星滴眼液滴眼預(yù)防感染。排除造模后發(fā)生感染的小鼠，60只小鼠均建模成功。

1.2.3 角膜上皮愈合情況的觀察及分析造模后0 h、24 h、48 h、72 h，兩組小鼠右眼使用100 g·L-1熒光素鈉溶液著染角膜上皮，裂隙燈藍(lán)鈷燈下觀察角膜上皮愈合情況，并用攝像系統(tǒng)拍攝圖像。觀察后用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊并用左氧氟沙星滴眼液滴眼預(yù)防感染。圖像使用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算角膜上皮缺損率。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查造模后48 h、72 h，將兩組小鼠用頸椎脫臼法處死，完整取下眼球，經(jīng)40 g·L-1多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，再垂直于角膜表面連續(xù)4 μm切片。HE染色觀察造模后72 h角膜組織結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)造模后48 h、72 h時(shí)角膜組織IL-1β的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞數(shù)。顯微鏡下觀察并拍攝圖像，使用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算基質(zhì)層中IL-1β的平均光密度值(mean optical density，MOD)，并對(duì)中性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組檢測(cè)結(jié)果比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 角膜上皮愈合的情況造模后24 h、48 h、72 h，治療組角膜上皮缺損率分別為(78.75±5.81)%、(21.58±4.53)%、(0.83±0.72)%，明顯低于對(duì)照組的(87.74±3.57)%、(32.21±4.02)%、(3.80±1.86)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。這說(shuō)明治療組的上皮增殖能力強(qiáng)于對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

2.2 角膜組織的HE染色結(jié)果造模后72 h，HE染色結(jié)果顯示：治療組角膜上皮生長(zhǎng)2～3層，上皮細(xì)胞排列欠規(guī)則；對(duì)照組角膜上皮生長(zhǎng)0～2層，上皮細(xì)胞排列紊亂。這表明甘草甜素溶液促進(jìn)了角膜上皮層的修復(fù)。見(jiàn)圖2。

2.3 角膜組織中IL-1β的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常角膜組織中，IL-1β僅在角膜上皮層和內(nèi)皮層表達(dá)，角膜基質(zhì)層中不表達(dá)。造模后48 h，兩組角膜基質(zhì)層中均可觀察到IL-1β的陽(yáng)性表達(dá)，治療組角膜基質(zhì)層中IL-1β的MOD為0.39±0.06，明顯低于對(duì)照組(0.60±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模后72 h，兩組角膜基質(zhì)層中IL-1β的陽(yáng)性表達(dá)均降低，治療組角膜基質(zhì)層中IL-1β的MOD為0.21±0.03，明顯低于對(duì)照組(0.31±0.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖1 兩組造模后0 h、24 h、48 h、72 h角膜上皮缺損情況(×25)

圖2 兩組造模后72 h時(shí)角膜組織的HE染色結(jié)果(×400)

2.4 角膜內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況MPO蛋白是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，通過(guò)檢測(cè)MPO的表達(dá)可顯示角膜內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常角膜基質(zhì)層中無(wú)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。造模后48 h，兩組角膜基質(zhì)層中均可觀察到MPO陽(yáng)性表達(dá)的中性粒細(xì)胞，著色呈棕褐色，中性粒細(xì)胞主要聚集在裸露的基質(zhì)和增殖上皮的交界區(qū)；治療組角膜基質(zhì)層的中性粒細(xì)胞數(shù)量為每200倍視野(93.33±3.18)個(gè)，較對(duì)照組[(142.66±4.50)個(gè)]明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模后72 h，兩組角膜基質(zhì)層的中性粒細(xì)胞數(shù)量大幅度減少，治療組為每200倍視野(10.66±5.13)個(gè)，較對(duì)照組[(40.00±6.08)個(gè)]明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

3 討論

角膜上皮損傷時(shí)，異常的愈合過(guò)程將會(huì)導(dǎo)致角膜水腫、新生血管及瘢痕的形成，造成視力不佳。目前已經(jīng)證實(shí)中性粒細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物可選擇性地黏附于角膜傷口的前緣，延緩角膜上皮的愈合[8]。另外，角膜上皮損傷時(shí)釋放的細(xì)胞因子，IL-1β、腫瘤壞死因子-α等，也可引起角膜基質(zhì)溶解、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管形成，從而延緩上皮愈合[9]。因此，降低角膜基質(zhì)層中IL-1β的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)將有助于促進(jìn)角膜上皮損傷愈合。

HMGB1作為一種重要的警報(bào)素，在青光眼、銅綠假單胞菌角膜炎等眼病中，既可通過(guò)NF-κB通路引起下游IL-1β的高表達(dá)，也可作為細(xì)胞因子趨化中性粒細(xì)胞的遷移，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[10-11]。甘草甜素作為HMGB1的有效抑制劑，是一種天然的三萜乙二醇結(jié)合物，存在于甘草的根、莖中；與其他的抗HMGB1單克隆抗體相比，其不僅可以抑制HMGB1的表達(dá)，還具有抗炎、抗病毒等多種藥理活性[12]。

本研究采取專用的去角膜上皮刀來(lái)制作角膜上皮損傷模型，與其他角膜上皮損傷模型(如乙醇加刀片刮除法)相比，此方法使研究更接近真實(shí)的角膜上皮損傷愈合過(guò)程。造模后48 h和72 h，治療組角膜基質(zhì)層中IL-1β的表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度均降低；表明甘草甜素溶液減輕了角膜上皮損傷愈合時(shí)的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，熒光素鈉染色和HE染色的結(jié)果都表明，甘草甜素溶液促進(jìn)了角膜上皮層的愈合。因此，甘草甜素可降低HMGB1的表達(dá)，進(jìn)而降低基質(zhì)中IL-1β的過(guò)表達(dá)以及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，最終減輕角膜上皮損傷后炎癥反應(yīng)，促進(jìn)角膜上皮愈合。