人眼角膜基質(zhì)生物力學(xué)特性研究△

薛超 向堯齊 王雁 沈岷 吳迪

透明的人眼角膜是眼球壁外層重要的結(jié)構(gòu)，除了提供眼球總屈光力的2/3，它的外形和位置決定了其對眼內(nèi)容物具有保護(hù)作用。疾病、外傷、手術(shù)、配戴角膜接觸鏡等均能夠通過改變角膜形狀進(jìn)而影響成像質(zhì)量。角膜生物力學(xué)特性研究有助于角膜擴(kuò)張癥、圓錐角膜等的早期診斷，也有助于評估一些臨床治療的有效性，如角膜屈光性手術(shù)、角膜交聯(lián)術(shù)等。此外，角膜生物力學(xué)特性研究在眼壓測量、青光眼管理等方面也具有重要作用。目前，由于人眼角膜的珍貴性，角膜生物力學(xué)的研究多以動物眼、人尸眼或病變角膜(如圓錐角膜)為研究對象，不能準(zhǔn)確描述正常人眼角膜組織材料的特性。然而，隨著飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(small incision lenticule extraction，SMILE)的出現(xiàn)，使獲得正常人眼新鮮角膜基質(zhì)組織成為可能。

本研究擬通過對SMILE術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡行單軸拉伸，進(jìn)行應(yīng)力-應(yīng)變實(shí)驗(yàn)、蠕變實(shí)驗(yàn)、應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)，得到人眼角膜基質(zhì)的應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系曲線、蠕變曲線和應(yīng)力松弛曲線，從而初步了解人眼角膜基質(zhì)的生物力學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試件制作對預(yù)行SMILE者行嚴(yán)格的術(shù)前篩查，包括裸眼視力、裂隙燈顯微鏡、直接眼底鏡、角膜地形圖、眼壓、驗(yàn)光等，排除標(biāo)準(zhǔn)包括：圓錐角膜或可疑圓錐角膜，活動性的眼部及全身疾病，眼部手術(shù)史、外傷史及其他影響角膜健康的疾病。最終納入45例患者共90只角膜基質(zhì)透鏡，其中男24例，女21例，年齡(21.02±3.74)歲，屈光度(-5.57±1.72)D。

所有手術(shù)均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師完成，SMILE使用VisuMax型飛秒激光器(Carl Zeiss Meditec AG，Jena，德國)完成。手術(shù)步驟參見文獻(xiàn)[1-3]。本研究經(jīng)天津市眼科醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均自愿接受手術(shù)并簽署知情同意書。

SMILE術(shù)中取出角膜基質(zhì)透鏡后，用龍膽紫標(biāo)記12點(diǎn)鐘位，然后立即放入角膜保存液(Eusol-C，Alchima，Padova，意大利)中置于4 ℃冰箱中保存，保存時(shí)間不超過24 h。角膜基質(zhì)透鏡直徑6.5 mm，厚度為(112.27±26.33)μm，具體角膜基質(zhì)透鏡的厚度由每個(gè)眼球的屈光度決定。開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，將角膜基質(zhì)透鏡放置于橡膠墊上展平后使用自制雙刃刀沿12點(diǎn)鐘位垂直剪切為寬度1 mm的角膜基質(zhì)試件，每個(gè)角膜基質(zhì)透鏡裁切后得到1個(gè)試件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法將試件夾持于夾具上，使用凱爾原位拉壓力學(xué)試驗(yàn)系統(tǒng)[型號IBTC-50，凱爾測控試驗(yàn)系統(tǒng)(天津)有限公司]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)先對試件進(jìn)行3次預(yù)調(diào)，遲滯環(huán)穩(wěn)定后正式開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，使用生理鹽水水浴裝置保持試件的濕潤。由于部分角膜基質(zhì)試件在實(shí)驗(yàn)過程中有滑脫、撕裂等現(xiàn)象，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完整，分析時(shí)將該部分角膜基質(zhì)試件排除，最終應(yīng)力-應(yīng)變實(shí)驗(yàn)測試了34條角膜基質(zhì)試件，蠕變實(shí)驗(yàn)測試了11條角膜基質(zhì)試件，應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)測試了6條角膜基質(zhì)試件。因不同角膜基質(zhì)試件應(yīng)力-應(yīng)變實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差較大，而蠕變實(shí)驗(yàn)與應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)不同角膜基質(zhì)試件間結(jié)果相對較為穩(wěn)定，故應(yīng)力-應(yīng)變實(shí)驗(yàn)較應(yīng)力松弛與蠕變實(shí)驗(yàn)測試了更多的角膜基質(zhì)試件。

1.2.1 應(yīng)力-應(yīng)變實(shí)驗(yàn)角膜基質(zhì)試件預(yù)調(diào)穩(wěn)定后，以0.01 mm·s-1的速度進(jìn)行單軸拉伸直至試件斷裂，記錄角膜基質(zhì)試件的低應(yīng)變區(qū)切線模量(low-strain tangent modulus，LSTM)、高應(yīng)變區(qū)切線模量(high-strain tangent modulus，HSTM)[4]及斷裂點(diǎn)的應(yīng)力和應(yīng)變，同時(shí)記錄0.01 MPa、0.02 MPa、0.03 MPa時(shí)角膜基質(zhì)試件的彈性模量。

1.2.2 蠕變實(shí)驗(yàn)角膜基質(zhì)試件預(yù)調(diào)穩(wěn)定后，以0.02 N·s-1的速度拉伸到1.00 N，維持此載荷不變，持續(xù)觀察600 s，以了解角膜基質(zhì)的蠕變情況。

1.2.3 應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)角膜基質(zhì)試件預(yù)調(diào)穩(wěn)定后，以0.02 mm·s-1的速度拉伸至初始長度的1.5倍，維持此長度不變持續(xù)觀察1 h，以了解角膜基質(zhì)的應(yīng)力松弛情況。

2 結(jié)果

2.1 角膜基質(zhì)試件預(yù)調(diào)圖1顯示了角膜基質(zhì)試件的預(yù)調(diào)載荷-位移曲線，可以看出，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，滯后環(huán)逐漸減小，經(jīng)過3次循環(huán)后，載荷-位移曲線穩(wěn)定，加載-卸載曲線接近可逆，此時(shí)可認(rèn)為角膜內(nèi)部能量損耗趨于零，故認(rèn)為預(yù)調(diào)3次已能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 角膜基質(zhì)試件的預(yù)調(diào)載荷-位移曲線

2.2 應(yīng)力-應(yīng)變實(shí)驗(yàn)圖2顯示了典型的角膜基質(zhì)試件應(yīng)力-應(yīng)變曲線，該曲線由四段組成，第一段OA段為正常生理作用范圍，載荷變化很小而變形迅速增大，OA段可以看作線彈性區(qū)；AB間呈非線性關(guān)系，隨著變形增大，載荷呈指數(shù)關(guān)系增加；第三段BC段近似為一直線；最后階段CD段，載荷與變形之間呈非線性關(guān)系；到D點(diǎn)時(shí)，材料被拉斷。將OA段及BC段的彈性模量分別視為LSTM、HSTM。LSTM、HSTM及斷裂點(diǎn)D的應(yīng)力及應(yīng)變被用來表征角膜基質(zhì)的生物力學(xué)特性。

本實(shí)驗(yàn)測試了34條角膜基質(zhì)試件，LSTM為(1.32±0.48)MPa，HSTM為(51.26±8.23)MPa，斷裂點(diǎn)應(yīng)變?yōu)?0.52±0.06)mm·mm-1，斷裂點(diǎn)應(yīng)力為(13.00±2.51)MPa。在應(yīng)力為0.01 MPa、0.02 MPa、0.03 MPa時(shí)，角膜基質(zhì)試件彈性模量分別為(0.89±0.25)MPa、(1.28±0.21)MPa、(1.69±0.18)MPa。生理狀態(tài)下角膜的彈性模量與應(yīng)力呈線性正相關(guān)。

LSTM與等效球鏡度數(shù)、角膜基質(zhì)透鏡厚度存在顯著相關(guān)性(r=0.340、-0.387，均為P<0.05)，與性別、年齡、中央角膜厚度均無顯著相關(guān)性(均為P>0.05)；HSTM同樣與等效球鏡度數(shù)、角膜基質(zhì)透鏡厚度存在顯著相關(guān)性(r=-0.358、0.379，均為P<0.05)，與性別、年齡、中央角膜厚度均無顯著相關(guān)性(均為P>0.05)。

圖2 角膜基質(zhì)試件的應(yīng)力-應(yīng)變曲線

2.3 蠕變實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)測試了11條角膜基質(zhì)試件，其蠕變曲線見圖3，在1.00 N恒定載荷下持續(xù)觀察600 s，角膜基質(zhì)試件形變隨時(shí)間延長而增大，早期變化較快，后期逐漸變緩，600 s時(shí)蠕變率為(4.57±1.67)%。由圖3可以看出，11條角膜基質(zhì)試件的蠕變曲線相對較為一致。

圖3 角膜基質(zhì)試件的蠕變曲線

2.4 應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)測試了6條角膜基質(zhì)試件，其應(yīng)力松弛曲線見圖4。應(yīng)力隨著時(shí)間的延長逐漸衰減，早期衰減較快，隨著時(shí)間的延長衰減趨于平緩，1 h時(shí)松弛率為(28.49±0.04)%。由圖4可以看出，6條角膜基質(zhì)試件的應(yīng)力松弛曲線趨勢也較為一致。

圖4 角膜基質(zhì)試件的應(yīng)力松弛曲線

3 討論

透明的人角膜是眼球壁外層重要的結(jié)構(gòu)，其具有獨(dú)特的生物力學(xué)特性[5-7]以保護(hù)眼球組織。角膜的生物力學(xué)被定義為在承受外界壓力時(shí)如何反應(yīng)和變形[8]，其與眼科的許多疾病以及角膜屈光性手術(shù)均密切相關(guān)[9]，測量角膜的生物力學(xué)特性有助于角膜擴(kuò)張癥及圓錐角膜等的早期診斷[10]，可用于角膜屈光手術(shù)、角膜交聯(lián)術(shù)乃至角膜接觸鏡的配戴等各種臨床治療有效性的評估。有研究表明，角膜生物力學(xué)特性對角膜屈光手術(shù)的最終結(jié)果和可預(yù)測性至關(guān)重要[11-12]。Roberts等[13]研究表明，角膜屈光手術(shù)后繼發(fā)性角膜擴(kuò)張癥最早的變化源于角膜生物力學(xué)特性的改變。近年來角膜生物力學(xué)特性的研究已成為熱點(diǎn)[14]。

由于角膜主要由致密排列于基質(zhì)板層間的膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)組成，而基質(zhì)層占角膜總厚度的90%，其膠原纖維成分和纖維結(jié)構(gòu)決定了最主要的角膜生物力學(xué)性能[15-17]。因此，對角膜基質(zhì)部分生物力學(xué)特性的研究有助于了解整個(gè)角膜的生物力學(xué)特性。作為典型的軟組織材料，角膜本身具有非線彈性。因角膜基質(zhì)含有大量的水分，決定了角膜具有黏彈性，主要包括黏滯性、蠕變和應(yīng)力松弛[18]。本研究使用SMILE術(shù)中取出的新鮮的角膜基質(zhì)透鏡進(jìn)行應(yīng)力-應(yīng)變實(shí)驗(yàn)、蠕變實(shí)驗(yàn)、應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)，目的是對人眼角膜基質(zhì)的生物力學(xué)特性有一初步了解。

本研究中，為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在獲取角膜基質(zhì)透鏡并標(biāo)記后，立即放入Eusol-C角膜保存液中進(jìn)行保存。以往的研究[19-20]顯示，該保存液可以在1周內(nèi)有效地保持角膜基質(zhì)的水合狀態(tài)。本研究中角膜基質(zhì)透鏡在角膜保存液中不超過24 h，在此期間即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)基本能夠保證角膜基質(zhì)試件維持在其生理狀態(tài)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

彈性模量是重要的生物力學(xué)參數(shù)，以往對人角膜彈性模量的報(bào)道差異較大[19，21-25]，從0.159 MPa[19]到57 MPa[26]不等。Glass等[21]認(rèn)為，這與角膜微結(jié)構(gòu)復(fù)雜，尸眼角膜水腫、淚膜消失、角膜不再透明有關(guān)，此外，溫度的改變及組織降解也會導(dǎo)致角膜生物力學(xué)特性的改變。由于角膜是黏彈性材料，不同的加載速率也會影響測得的彈性模量的大小。本研究中獲得的LSTM為(1.32±0.48)MPa，HSTM為(51.26±8.23)MPa，斷裂點(diǎn)應(yīng)變?yōu)?0.52±0.06)mm·mm-1，斷裂點(diǎn)應(yīng)力為(13.00±2.51)MPa，這是首次報(bào)道人眼新鮮角膜的彈性模量及斷裂點(diǎn)的應(yīng)力、應(yīng)變數(shù)值。同之前的基于尸眼或病變角膜的研究相比，本研究LSTM和HSTM均相對較高。其原因可能有：(1)之前的研究是基于尸眼或病變角膜，有可能由于組織的分解導(dǎo)致生物力學(xué)特性的改變。(2)有研究[27-28]顯示，角膜上皮層和后彈力層對角膜生物力學(xué)貢獻(xiàn)較小。Labate等[29]基于人尸眼的研究顯示，人眼角膜基質(zhì)彈性模量從前向后逐漸變小，前基質(zhì)層彈性模量最大?？梢酝茢啵瑢τ谕瑯雍穸鹊慕悄せ|(zhì)試件，前基質(zhì)層較全層角膜組織生物力學(xué)性能更好。所以本研究中來自前基質(zhì)層的角膜基質(zhì)透鏡較之前來自全層角膜厚度的試件生物力學(xué)性能更好，彈性模量可能較高，這也從實(shí)驗(yàn)角度印證了這一特性。

本研究中，LSTM 相對HSTM明顯較小，這是因?yàn)榻悄な堑湫偷能浗M織材料，具有非線彈性的特性，其切線模量隨應(yīng)力的增大而增大[30]。本研究結(jié)果顯示，生理狀態(tài)下，(即應(yīng)力為0.01 MPa、0.02 MPa、0.03 MPa對應(yīng)的狀態(tài)[31])角膜的彈性模量與應(yīng)力呈線性正相關(guān)。

蠕變是指將試件突加一定的應(yīng)力，然后此應(yīng)力保持常數(shù)，而試件繼續(xù)發(fā)生變形的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)測試了11條角膜基質(zhì)試件，在1.00 N恒定載荷下持續(xù)觀察600 s，由蠕變曲線可以看出，角膜基質(zhì)試件形變隨時(shí)間延長而增大，早期變化較快，后期逐漸變緩，600 s時(shí)蠕變率為(4.57±1.67)%。將試件突加一定應(yīng)變，然后保持此應(yīng)變量，應(yīng)力逐漸減少的過程稱為應(yīng)力松弛。本實(shí)驗(yàn)測試了6條角膜基質(zhì)試件，角膜基質(zhì)試件預(yù)調(diào)穩(wěn)定后，以0.02 mm·s-1的速度拉伸至初始長度的1.5倍，維持此長度不變持續(xù)觀察1 h，1 h時(shí)松弛率為(28.49±0.04)%。楊堅(jiān)等[32]使用角膜移植手術(shù)后剩余的周邊角膜進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，300 s內(nèi)伸長比開始時(shí)蠕變增加了0.7%；保持初長度為原長度的1.3倍不變，計(jì)算出松弛率為14.4%。這可能是由于角膜邊緣與鞏膜相連，膠原纖維排列比較致密，從而使得角膜邊緣組織具有較強(qiáng)的蠕變性和松弛性[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同人眼角膜基質(zhì)試件蠕變曲線相對較為集中，應(yīng)力松弛曲線趨勢也較為一致，故只進(jìn)行了少數(shù)角膜基質(zhì)試件的測試，后面的研究尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。

綜上所述，本研究首次使用新鮮的角膜基質(zhì)透鏡得出了正常角膜基質(zhì)組織的生物力學(xué)特性，初步得到人眼角膜基質(zhì)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線、蠕變曲線和應(yīng)力松弛曲線，給出了LSTM、HSTM及生理狀態(tài)的彈性模量。由于角膜組織的生物力學(xué)特性相對復(fù)雜，而臨床意義重大，本研究或許為難以獲得的角膜實(shí)驗(yàn)材料提供新的研究途徑和新思路，希望能夠?yàn)樯钊虢悄ど锪W(xué)特性的臨床和基礎(chǔ)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。