乳源抗菌－免疫調(diào)節(jié)融合肽對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響

唐宜桂，李小勤，劉 琛，雷 婷，秦宜德

牛乳鐵蛋白肽(bovine lactoferricin，LfcinB)來源于牛乳鐵蛋白N端的25個氨基酸殘基，是一種具有抗菌活性的生物活性肽［1］。乳源免疫調(diào)節(jié)肽是源于牛乳β-酪蛋白第63～68氨基酸殘基上的短肽，其氨基酸序列為PGPIPN，具有抑制腫瘤生長等活性［2－4］。乳源抗菌 －免疫調(diào)節(jié)融合肽(antibacterial-immunomodulating fusion peptide，AIFP)是通過柔性連接臂將上述兩種小分子肽連接形成的融合多肽。該實驗室的前期研究［3－4］顯示，卵巢癌細胞株轉(zhuǎn)染了該融合肽基因能明顯抑制腫瘤細胞生長。該研究將探討AIFP直接作用于卵巢癌細胞，分析其對卵巢癌細胞增殖的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、卵巢癌臨床原代細胞 卵巢癌細胞株

SKOV3由本實驗室保存。卵巢癌樣本取自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)室，由本實驗室進行原代培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 AIFP(上海生工生物工程有限公司合成)，純度＞99.8%;紫杉醇購自深圳萬樂藥業(yè);胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、β-雌二醇(β-Estradiol)購自美國 Peprotech公司;MTT、1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司;Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白酶購自美國Life公司;RT-PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人卵巢癌細胞株SKOV3培養(yǎng)在含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)中，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。從無菌臨床手術(shù)室取人卵巢癌組織塊，放于預先準備的無菌的盛有PBS緩沖液的培養(yǎng)瓶中，在無菌環(huán)境中用PBS緩沖液沖洗癌組織塊，然后用無菌眼科剪剪成1 mm3左右的小塊，放入無菌15 ml離心管中，用0.05%的Ⅰ型膠原酶在37℃消化20～30 min后，取上層細胞懸液，800 r/min離心10 min，收集細胞計數(shù)，配制成105個/ml的細胞懸液，并用臺盼藍對細胞活力進行檢測，將細胞培養(yǎng)在含有EGF、IGE和β-雌二醇的RPMI-1640+10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

1.3.2 熒光免疫方法鑒定原代卵巢癌細胞 將無菌的細胞爬片放在6孔板孔底，培養(yǎng)的原代細胞用4%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度至10 000個，每孔加入1 ml細胞懸液，放于37℃、5%CO2中培養(yǎng)培養(yǎng)過夜，第2天，吸盡細胞培養(yǎng)液，加入新鮮配制的2%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS洗3次，每次5 min。用0.3%的Triton-100對細胞透化處理10 min，PBS洗3遍，每次5 min。用10%二抗同源血清封閉30 min，PBS洗3遍，每次5 min。加入一抗CK7(1∶200)，4℃孵育過夜(大于18 h)，PBS洗3遍，每次5 min。加入熒光二抗(1∶100)，37℃孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min。加入 Hoechest 33258染色細胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min，去除多余的Hoechest 33258。取出細胞爬片，正面向下放在載玻片上封片。在熒光顯微鏡下觀察。上述的試劑均用PBS配制。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖 對數(shù)生長期細胞配制成細胞懸液，按每孔5 000個細胞種于96孔板中，待細胞貼壁后，以紫杉醇作為陽性藥物，每孔加入不同濃度的AIFP，分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)孵育 4 h 后，終止培養(yǎng)，吸取孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，490 nm波長下測定各孔吸光度(OD)，每組5個復孔，計算每組均值。細胞存活率(%)=［(OD實驗組－ OD空白)/(OD陰性對照組－ OD空白)］×100%。

1.3.4 AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡 用不含EDTA的0.4%胰蛋白酶消化并收集對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度，接種于6孔板中，每孔接種細胞104個，置37℃、5%CO2中培養(yǎng)至細胞貼壁，每孔加入不同濃度的AIFP，分別培養(yǎng)24、48、72 h后收集細胞。用冷的 PBS洗滌2次，每管加入500 μl Binding Buffer懸浮細胞，每管加入5 μl AnnexinVFITC混勻，然后加入5 μl PI混勻，室溫避光反應15 min后，在流式細胞儀上進行檢測，并以未處理的細胞為陰性對照，紫杉醇處理的細胞為陽性對照，用Modfit軟件進行分析。

1.3.5 RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達 設(shè)計基因 Akt、CDC25C、cyclinB1及內(nèi)參 β-actin引物序列和片段長度見表1。PCR目的基因引物及內(nèi)參由上海生工生物工程有限公司合成。TRIzol法提取總RNA，然后分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進行PCR擴增。PCR條件:Akt為94℃ 4 min，94℃ 30 s，59℃退火30 s，72℃ 30 s。CDC25C為94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃退火30 s，72℃ 30 s。cyclinB1為94℃ 4 min，94 ℃ 30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s。βactin為94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃退火30 s，72℃ 30 s。目的基因與內(nèi)參均擴增35個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，用t檢驗進行差異分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光法檢測原代細胞的純度 特異性抗體CK7作為一抗，用帶有FITC免疫熒光的二抗，對癌細胞膜進行染色，用Hochest 33258對細胞核進行染色。熒光顯微鏡下，癌細胞膜帶有綠色熒光，癌細胞核帶藍色熒光，見圖1。從圖1可知，培養(yǎng)的細胞是卵巢癌細胞，其純度為84.61%，可以進行下步實驗。

表1 Akt、CDC25C、cyclinB1及內(nèi)參β-actin引物序列和片段長度

圖1 免疫熒光鑒定原代卵巢癌細胞的結(jié)果 ×200

2.2 AIFP對SKOV3細胞增殖的影響 不同濃度的融合肽作用于SKOV3細胞不同時間，隨著濃度的增加和作用時間的延長，細胞的存活率降低。以不處理作為陰性對照，以0.5 μg/ml紫杉醇處理作為陽性對照，AIFP組對SKOV3細胞增殖的抑制率隨AIFP濃度增加和作用時間的延長而增加，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。根據(jù)數(shù)據(jù)作出生長抑制曲線，然后根據(jù)曲線求出AIFP作用于SKOV3細胞24、48和72 h的ID50分別為2.75 ×10－4、3.96 ×10－5和 3.96 ×10－6mg/ml。見圖2。

圖2 AIFP對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響

2.3 AIFP肽對原代卵巢癌細胞增殖的影響 不同濃度的AIFP作用于原代卵巢癌細胞24、48、72 h后的細胞存活率，以0.5 μg/ml的紫杉醇做為陽性對照，培養(yǎng)液作為陰性對照。根據(jù)數(shù)據(jù)作出生長抑制曲線，然后根據(jù)曲線求出AIFP作用于原代卵巢癌細胞 24、48、72 h 的 ID50分別為 1.74 ×10－4、2.33×10－5和 3.12 × 10－6mg/ml。與陰性對照組比較AIFP各濃度處理原代卵巢癌細胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，且有時間和劑量依賴性，見圖3。

圖3 AIFP對原代卵巢癌細胞增殖的影響

圖4 AIFP對原代卵巢癌細胞凋亡的影響

2.4 AIFP對原代卵巢癌細胞和SKOV3細胞凋亡的影響 用不同濃度的AIFP作用于原代卵巢癌細胞和SKOV3細胞24、48和72 h后細胞凋亡的結(jié)果，培養(yǎng)液作為陰性對照，陽性對照用0.5 μg/ml紫杉醇處理，與陰性對照組比較AIFP組對卵巢癌細胞凋亡的影響隨AIFP濃度增加和作用時間的延長而增加，見圖 4、5。

圖5 AIFP對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響

2.5 RT-PCR檢測卵巢癌相關(guān)基因表達水平的變化 AIFP下調(diào) SKOV3細胞中 Akt、CDC25C、cyclinB1基因的表達水平，且隨AIFP濃度的增加和作用時間的延長而更加明顯，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，見圖6、7。

圖6 AIFP對SKOV3細胞凋亡和周期相關(guān)基因表達的影響

3 討論

LfcinB是一類富含色氨酸的小分子抗菌肽，由牛乳鐵蛋白在消化道內(nèi)經(jīng)胃蛋白酶水解而產(chǎn)生。LfcinB具有抗菌、抑殺腫瘤細胞［5－6］等多種生物學功能，可用于保健食品、化妝品、藥品等。乳源免疫調(diào)節(jié)肽能促進機體的免疫、抗氧化、延緩機體衰老和抗疲勞等多種功能。本實驗室前期研究［7－8］顯示，將LfcinB和免疫調(diào)節(jié)肽通過柔性連接臂［9］(GGGGS)連接，形成融合肽，并在大腸桿菌表達系統(tǒng)中穩(wěn)定表達。研究［10］表明融合肽在抑制細胞增殖和抗菌方面有一定的效果，本實驗將在前期研究結(jié)果中進一步研究融合肽對卵巢癌細胞株SKOV3細胞增殖和凋亡方面的影響。

圖7 AIFP對SKOV3細胞凋亡和周期相關(guān)基因表達的影響

Akt又稱蛋白激酶B(protein kinases B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)下游的靶蛋白，是PI3K/Akt信號途徑的中心環(huán)節(jié)，該信號途徑參與調(diào)節(jié)細胞的存活、凋亡、擴增、惡性腫瘤的發(fā)生及化療耐藥等［11］。PI3K/Akt卵巢癌中高表達，與卵巢癌細胞的凋亡相關(guān)［12］。

CDC25C即細胞分裂周期蛋白25同源蛋白，是一種細胞分裂周期蛋白，在真核細胞有絲分裂中期重要作用，是調(diào)控細胞周期進入M期的關(guān)鍵因子之一。CDC25C是 CDC2/cyclinB的主要激活物，CDC2/cyclinB是一個主要的G2/M期轉(zhuǎn)變在G2期檢查點的總開關(guān)［13］。當CDC25C磷酸酶活性受到抑制時，CDC2/cyclinB復合物的活性也將受到抑制，G2期檢查點的總開關(guān)處于“關(guān)閉”狀態(tài)，發(fā)生G2/M期阻滯。

cyclinB即細胞周期蛋白B，分為6中亞型，cyclinB1-6，在S期開始表達，在G2/M期達到峰值，到有絲分裂中后期消失［14］。cyclinB的過表達能夠促進G2/M期轉(zhuǎn)換，甚至導致細胞增生失控以及惡性轉(zhuǎn)化。研究［15］表明，用 RNA干擾的方法抑制 cyclinB表達，結(jié)果造成G2/M期阻滯，細胞生長被抑制，并誘導細胞凋亡。

本實驗用MTT法檢測顯示AIFP作用卵巢癌細胞株SKOV3細胞后，細胞的增殖減少，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，AIFP作用后的 SKOV3細胞的 Akt、CDC25C和cyclinB1在一定范圍內(nèi)隨時間和劑量的增加表達水平降低，說明AIFP對SKOV3細胞增殖和凋亡的影響可能是通過影響Akt、CDC25C和cyclinB1而發(fā)揮作用，為深入研究AIFP抗腫瘤的作用機制提供了可靠的依據(jù)。

［1］Ellman M B，Kim J，An H S，et al.Lactoferricin enhances BMP7-stimulated anabolic pathways in intervertebral disc cells［J］.Gene，2013，524(2):282 －91.

［2］Wei W，F(xiàn)ang G，Cai W，et al.PGPIPN，a therapeutic hexapeptide，suppressed human ovarian cancer growth by targeting BCL2［J］.PLoS One，2013，8(4):e60701.

［3］魏 彩，秦宜德，鄭 欣，等.乳源免疫調(diào)節(jié)肽體外抑制人卵巢癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移［J］.中國藥理學通報，2013，29(1):42－8.

［4］鄭 欣，何曉光，張文曉，等.免疫調(diào)節(jié)肽對卵巢癌skov3細胞凋亡及相關(guān)基因表達的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2013，48(7):758－62.

［5］Fiat A M，Samour D，Jolles P，et al.Biologically active peptides from milk proteins with emphasis on two examples concerning antithrombotic and immunomodulating activities［J］Dairy Sci，1993，76(1):301－10.

［6］Mader J S，Richardson A，Salsman J，et al.Bovine lactoferricin causes apoptosis in Jurkat T-leukemia cells by sequential permeabili-zation of the cell membrane and targeting ofmitochondria［J］.Exp Cell Res，2007，313(12):2634 －50.

［7］李素萍，秦宜德，董瓊珠，等.飼喂乳源免疫調(diào)節(jié)肽對大鼠生長和免疫的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2005，40(6):499－501.

［8］顧 芳，秦宜德，董華勝，等.乳源免疫調(diào)節(jié)肽對小鼠抗氧化和抗疲勞作用研究［J］.營養(yǎng)學報，2006，28(4):326 －8.

［9］Ikeda M，Nozaki A，Sugiyama K，et al.Characterization of antiviral activity of lactoferrin against hepatitis C virus infection in human cultured cells［J］.Virus Res，2000，66(1):51 － 63.

［10］張文曉，秦宜德，何曉光，等.乳鐵蛋白抗菌－乳源免疫調(diào)節(jié)肽的載體構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達和純化［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2012，47(6):641 －4.

［11］Levine D A，Bogomolniy F，Yee C J，et al.Frequent mutation of the PI3KCA gene in ovarian and breast cancers［J］.Clin Cancer Res，2005，11(8):2875 －8.

［12］Arboleda M J，Lyons J F，Kabbinavar F F，et al.Overexpression of Akt2 protein kinase beta leads to up-regulation of betal integrins increased invasion，and metastasis of human breast and ovarian cancer cells［J］.Cancer Res，2003，63(2):196 －206.

［13］Shibuya E K.G2cell cycle arrest-a direct link between PKA and Cdc25C［J］.Cell Cycle，2003，2(1):39 －41.

［14］Jean C S，Se J J，F(xiàn)adlo R K，et al.Overexpression of cyclin B1 in early-stage non-small cell lung cancer and its clinical implication［J］.Cancer Res，2000，60(1):4000 －4.

［15］Ho Y S，Duh J S，Jeng J H，et al.Griseofulvin potentiates antitumorigenesis effects of no odazole through indution of apoptosis and G2/M cell cycle arrest in human coloredal cancer cells［J］.Int J Cancer，2001，91(3):393－ 401.