凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病抗性的誘導(dǎo)效果

孟祥南 馬章通 李維虎 魯成偉 張鵬 范海延

摘? ? 要： 為明確植物誘抗劑凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病（Corynespora cassiicola）的誘導(dǎo)抗病效果及最佳誘導(dǎo)方案，測(cè)定了凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌的抑制效果，研究了不同誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)次數(shù)、誘導(dǎo)間隔期以及誘導(dǎo)持續(xù)期對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的誘抗效果。結(jié)果表明，凈都煞本身對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌不具有殺傷力，但對(duì)黃瓜幼苗具有明顯的誘抗效果;2.0 mL·L-1的凈都煞間隔7 d誘導(dǎo)黃瓜3次，持續(xù)1 d對(duì)棒孢葉斑病菌的防效最高，達(dá)到68.93%。此研究結(jié)果為黃瓜棒孢葉斑病防治提供了新手段。

關(guān)鍵詞：黃瓜;棒孢葉斑病;凈都煞;誘導(dǎo)抗病性

Induced resistance of cucumber to Corynespora cassiicola by Jingdusha

MENG Xiangnan1， MA Zhangtong1， LI Weihu1， LU Chengwei1， ZHANG Peng1， FAN Haiyan1，2

（1. College of Bioscience and Biotechnology， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， Liaoning， China; 2. Key Laboratory of Protected Horticulture of Ministry of Education， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， Liaoning， China）

Abstract： In order to identify the resistance effects and the best induction method of Jingdusha on cucumber resistance to Corynespora cassiicola， the bacteriostatic activity and induced-resistance effects of Jingdusha with different inducing concentrations， inducing times， inducing intervals and inducing durations were determined in this study. The results showed that Jingdusha itself had no bactericidal activity， but had significant induce resistance effect on cucumber seedlings. The highest control efficacy was 69.93%， when cucumber plants were treated with Jingdusha at 2.0 mL·L-1 3 times at an interval of 7 d and last for 1 d. This study provided a new method for the control of C.cassiicola.

Key words： Cucumber; Corynespora cassiicola; Jingdusha; Induced resistance

黃瓜棒孢葉斑病又稱靶斑病、褐斑病，是由半知菌亞門(mén)絲孢目棒孢屬真菌（Corynespora cassiicola）侵染所致的，在遼寧、黑龍江、河北、河南、山東、廣東、上海以及寧夏等地區(qū)均普遍發(fā)生[1]。棒孢葉斑病寄主范圍廣，主要為害黃瓜和番茄，造成黃瓜減產(chǎn)20%～70%[2]。近年來(lái)，該病對(duì)黃瓜生產(chǎn)的危害日益加重。大田生產(chǎn)中主要以施用化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治黃瓜棒孢葉斑病，但連續(xù)用藥使得病原菌產(chǎn)生抗藥性且造成環(huán)境污染[3-4]。

誘抗劑是可誘導(dǎo)植物激發(fā)自身免疫系統(tǒng)的某種特定的微生物或植物分子，具有高效性、安全性、持續(xù)性、廣譜性等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。目前利用誘抗劑誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生抗病性來(lái)防治瓜菜病害已取得了良好效果[7]，但仍缺乏誘抗劑在以黃瓜為宿主的抗病方面的研究。凈都煞是一種植物免疫誘抗劑，其主要成分是殼聚糖、生物碘以及天然氨基酸。其中，殼聚糖能夠有效提高果蔬病害防效，如番茄抗灰霉病、黃瓜抗腐霉病、南瓜抗白粉病、馬鈴薯抗環(huán)腐病以及棉花抗炭疽病等[8-9]。但凈都煞誘導(dǎo)黃瓜抗棒孢葉斑病的作用效果仍不明確。因此，筆者從凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌的抑制效果入手，主要研究了凈都煞不同施用濃度、施用次數(shù)、施用間隔期以及施用持續(xù)期對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的誘抗效果，旨在為實(shí)際生產(chǎn)中凈都煞誘導(dǎo)黃瓜抗棒孢葉斑病的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2018年6—11月在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物培養(yǎng)室進(jìn)行。供試植物誘抗劑凈都煞由中國(guó)青島海大生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。供試黃瓜品種‘津科1號(hào)由天津市科興蔬菜研究所提供。供試病原菌黃瓜棒孢葉斑病菌（Corynespora cassiicola）購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保存中心。

1.2 方法

1.2.1 凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌的抑菌活性 在無(wú)菌條件下，將凈都煞定量加入預(yù)先融化的PDA培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL H2O）中，搖勻后等量倒入培養(yǎng)皿，制成含有不同體積分?jǐn)?shù)（0.5、1.0、1.5和2.0 mL·L-1）凈都煞的PDA固體平板。對(duì)照殺菌劑為1 mL·L-1的35%二氰·戊唑醇。用無(wú)菌打孔器切取菌餅，菌絲面朝下接種于含藥平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。分別培養(yǎng)4 d和8 d后測(cè)量菌落直徑，記錄病原菌菌絲生長(zhǎng)情況。

1.2.2 凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌的誘導(dǎo)抗病效果 棒孢葉斑病菌孢子懸浮液的制備：將培養(yǎng)基上的孢子用無(wú)菌水沖刷下來(lái)，2層紗布濾去菌絲，將孢子濃度調(diào)至103個(gè)·mL-1用于接種。

為了確定凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的最佳誘導(dǎo)濃度，用蒸餾水將凈都煞配成0.5、1.0、1.5 和2.0 mL·L-1的溶液。對(duì)2葉1心期的黃瓜葉面進(jìn)行噴霧處理，噴霧量以植株全葉濕潤(rùn)、溶液不致滴液為準(zhǔn)。每隔7 d誘導(dǎo)1次，共誘導(dǎo)3次。最后1次誘導(dǎo)后24 h在各處理葉片上接種棒孢葉斑病菌孢子懸浮液，接種量以葉片表面不向下滴水為宜。清水對(duì)照為蒸餾水噴霧處理黃瓜葉面后接種棒孢葉斑病菌，待清水對(duì)照組發(fā)病均勻時(shí)調(diào)查病情指數(shù)。以35%二氰·戊唑醇2 000倍液噴霧處理作為殺菌劑對(duì)照。以上各處理均設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)30株苗。

為了確定凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的最佳誘導(dǎo)間隔期，采用上述確定的凈都煞的最佳誘導(dǎo)濃度（加0.01% Tween80表面活性劑），對(duì)2葉1心期的黃瓜進(jìn)行葉面噴施，誘導(dǎo)3次，誘導(dǎo)間隔期分別為2、5、7 d，誘導(dǎo)及接種方法均同上。

為了確定凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的最佳誘導(dǎo)次數(shù)，采用上述確定的凈都煞的最佳誘導(dǎo)濃度（加0.01% Tween80表面活性劑）以及最適誘導(dǎo)間隔期，對(duì)2葉1心期的黃瓜進(jìn)行葉面噴施，分別噴霧誘導(dǎo)3次、2次及1次，誘導(dǎo)及接種方法均同上。

為了確定凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的最佳誘導(dǎo)持續(xù)期，采用上述確定的凈都煞的最佳誘導(dǎo)濃度（加0.01% Tween 80表面活性劑）、最適誘導(dǎo)次數(shù)以及最佳誘導(dǎo)間隔期，分別于最后一次誘導(dǎo)后1、3、5、7 d接種黃瓜棒孢葉斑病菌，誘導(dǎo)及接種方法均同上。

黃瓜棒孢葉斑病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]：0級(jí)，無(wú)病斑;1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下;3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積6%～25%;5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積26%～50%;7級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積51%～75%;9級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積76%以上。病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）×100。

相對(duì)防治效果依照李少波等[11]的方法進(jìn)行計(jì)算。相對(duì)防治效果/%=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件中ANOVA方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌的抑菌效果

測(cè)定凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌的抑制效果時(shí)發(fā)現(xiàn)（表1），不同體積分?jǐn)?shù)的凈都煞（2.0、1.5、1.0、0.5 mL·L-1）均無(wú)明顯殺菌力，抑菌率均低于10%。而對(duì)照殺菌劑二氰·戊唑醇在接菌后4 d和8 d的抑菌率分別為100%和75.32%，具有強(qiáng)殺菌力。說(shuō)明凈都煞本身不具有殺菌力，而是通過(guò)誘導(dǎo)黃瓜自身產(chǎn)生抗性來(lái)抵抗病原菌的侵染。

2.2 不同濃度凈都煞對(duì)黃瓜的誘導(dǎo)抗病效果

由表2可以看出，不同濃度凈都煞處理的黃瓜幼苗在一定程度上都產(chǎn)生了抗性，相對(duì)防效均在35%以上。其中，2.0 mL·L-1凈都煞對(duì)黃瓜的誘導(dǎo)抗病效果最佳，為68.93%，而對(duì)照殺菌劑二氰·戊唑醇的相對(duì)防效為29.95%。

2.3 凈都煞誘導(dǎo)次數(shù)對(duì)黃瓜的誘導(dǎo)抗病效果

2.0 mL·L-1的凈都煞對(duì)黃瓜進(jìn)行葉面噴霧誘導(dǎo)，每隔7 d誘導(dǎo)1次。噴霧誘導(dǎo)1次或2次時(shí)，對(duì)棒孢葉斑病的誘抗效果均不明顯，誘導(dǎo)3次后，對(duì)棒孢葉斑病的誘抗效果最佳，達(dá)到68.93%。對(duì)照殺菌劑二氰·戊唑醇噴霧處理黃瓜葉片3次后，其防治效果為29.95%，低于凈都煞誘導(dǎo)處理（表3）。由此可見(jiàn)，凈都煞的最佳誘導(dǎo)次數(shù)為3次。

2.4 凈都煞誘導(dǎo)間隔期對(duì)黃瓜的誘導(dǎo)抗病效果

凈都煞對(duì)黃瓜抗棒孢葉斑病的效果與誘導(dǎo)間隔期有關(guān)，2.0 mL·L-1的凈都煞對(duì)黃瓜葉面進(jìn)行噴霧處理，共誘導(dǎo)3次，隨著誘導(dǎo)間隔期的延長(zhǎng)，對(duì)棒孢葉斑病的誘抗效果有加強(qiáng)趨勢(shì)，當(dāng)間隔期為7 d時(shí)，對(duì)棒孢葉斑病的誘抗效果最佳，為68.93%，始終顯著高于對(duì)照殺菌劑二氰·戊唑醇的防效（表4）。

2.5 凈都煞誘導(dǎo)持續(xù)期對(duì)黃瓜的誘導(dǎo)抗病效果

室溫培養(yǎng)條件下，2.0 mL·L-1的凈都煞對(duì)黃瓜進(jìn)行葉面噴施誘導(dǎo)，每隔7 d誘導(dǎo)1次，共誘導(dǎo)3次，分別于最后1次誘導(dǎo)后1、3、5、7 d接種黃瓜棒孢葉斑病菌。結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)持續(xù)期的延長(zhǎng)，對(duì)棒孢葉斑病的誘抗效果有減弱趨勢(shì)（表5）。結(jié)合前期研究結(jié)果，說(shuō)明2.0 mL·L-1凈都煞誘導(dǎo)3次、誘導(dǎo)間隔期7 d、持續(xù)期1 d為最佳施用方案。

3 討論與結(jié)論

目前，防治黃瓜棒孢葉斑病的主要手段是培育抗性品種，但存在育種周期長(zhǎng)、抗性喪失快等問(wèn)題，因此，僅依賴抗性育種解決黃瓜棒孢葉斑病危害是不現(xiàn)實(shí)的。加強(qiáng)栽培管理、合理輪作、施用藥劑以及生態(tài)防治等措施也未能從根本上解決棒孢葉斑病對(duì)黃瓜生產(chǎn)的危害。其中，長(zhǎng)期施用化學(xué)藥劑，使得病原菌產(chǎn)生抗藥性，如苯并咪唑類和QoI類對(duì)黃瓜棒孢葉斑病已失去防效[12]。近年來(lái)，利用誘抗劑激發(fā)植物自身免疫力逐漸成為果蔬病害防治的發(fā)展方向。

筆者以黃瓜棒孢葉斑病為研究對(duì)象，探究?jī)舳忌返目剐哉T導(dǎo)效果，通過(guò)抑菌效果測(cè)定發(fā)現(xiàn)不同濃度的凈都煞對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌的菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，抑菌率均在10%以下，說(shuō)明了誘抗劑本身并不存在抑菌能力，這與前人研究結(jié)果相一致[13]。Sequeira[14]和劉喜存等[7]研究表明植物的誘導(dǎo)抗病性具有時(shí)效性的弊端，本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)持續(xù)期的延長(zhǎng)，對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的誘抗效果有減弱趨勢(shì)，但始終顯著高于對(duì)照殺菌劑二氰·戊唑醇的防效。誘抗劑的施用方式直接影響對(duì)病害的誘抗效果[15-16]，為此，筆者分別從誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)次數(shù)、誘導(dǎo)間隔期以及誘導(dǎo)持續(xù)期方面優(yōu)化凈都煞的施用方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2.0 mL·L-1凈都煞誘導(dǎo)3次、誘導(dǎo)間隔期7 d、持續(xù)期1 d對(duì)黃瓜幼苗的誘抗效果最好，實(shí)際生產(chǎn)中可適時(shí)噴施凈都煞以減少棒孢葉斑病造成的經(jīng)濟(jì)損失。