外源NAA對甜瓜嫁接愈合關(guān)鍵期保護性酶活性及相關(guān)基因表達的影響

張穎 劉義玲 湯雨凡 許傳強

摘 要：通過分析外源施用植物激素NAA（萘乙酸）條件下甜瓜嫁接愈合3個關(guān)鍵時期（隔離層形成期、愈傷組織形成期、維管束橋形成期）保護性酶活性及相關(guān)基因表達的變化，探析外源施用NAA對甜瓜愈合過程中生理及其基因表達特性的影響。以蘸取清水的嫁接苗為對照，外源施用40 mg·L-1 NAA的嫁接苗為處理，薄皮甜瓜‘銀泉一號為接穗，白籽南瓜‘圣砧一號為砧木，采用頂端貼接法嫁接。利用石蠟切片篩選嫁接愈合關(guān)鍵時期，測定嫁接愈合過程中4種關(guān)鍵代謝酶（SOD、POD、PPO和PAL）活性，并利用實時熒光定量（qRT-PCR）測定其相關(guān)基因表達量。通過石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，外源NAA處理后，愈傷組織形成期和維管束橋形成期較對照提前1 d。SOD、POD酶活性呈先升高后降低的趨勢，在愈傷組織形成期達到最高值，且酶活性顯著高于對照，PAL酶活性在愈合過程中均高于對照，且在維管束橋形成時期達到最高值。PPO酶活性在隔離層形成期顯著高于對照，隨后其活性略低于對照，但差異不顯著。除CmPOD外，外源NAA處理能夠顯著提高CmFe-SOD、CmCu-Zn-SOD、CmMn-SOD、CmPPO相對表達量，且其變化趨勢與酶活性基本一致。綜合分析表明，外源施用NAA后，縮短了甜瓜嫁接苗的愈合期，并且能夠誘導(dǎo)影響嫁接愈合的關(guān)鍵酶基因表達，提高其相關(guān)酶活性，進而促進甜瓜嫁接苗的愈合進程。

關(guān)鍵字：甜瓜;嫁接愈合;NAA;保護性酶;基因表達

Effects of exogenous NAA on the protective enzymes activities and related genes expression at the key stages of melon graft healing

ZHANG Ying1，LIU Yiling1，TANG Yufan2，XU Chuanqiang1

（1. Key Laboratory of Protected Horticulture（Shenyang Agricultural University），Ministry of Education / National & Local Joint Engineering Research Center of Northern Horticultural Facilities Design & Application Technology （Liaoning） / College of Horticulture， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， Liaoning， China：2. College of Horticulture，Jilin Agricultural University，Changchun 130118， Jilin， China）

Abstract： The protective enzyme activities and related gene expression were analyzed to investigate the effects of exogenous NAA （naphthalene acetic acid） application on the physiological and related genes expression characteristics at three key stages of melon graft healing process （isolated layer formation， callus formation， vascular bundle formation）. In this experiment， the grafted seedlings that graft union dipped 40 mg×L-1 NAA were used as the treatment， and those dipped water were used as the control. We used the oriental melon ‘Yinquan No. 1 as the scion， and the white-seed pumpkin 'Shengzhen No.1' as the rootstock. Splice approach grafting was used as the grafting method. The paraffin sections screened out the key stages of graft healing process. The activities of four key metabolic enzymes （SOD， POD， PPO and PAL） during graft healing were determined， and the expression of related genes was determined by real-time quantitative quantification （qRT-PCR）. It was observed by paraffin sections that the formation of the callus and vascular bundle were 1 day earlier than the control by exogenous NAA treatment. The activities of SOD and POD increased first and then decreased， reached the highest value at the stage of callus formation， and the enzyme activities were significantly higher than that of control. The activities of PAL were higher than that of control and reached the highest value at the formation of vascular bundle. The activities of PPO were significantly higher than that of control at the formation of the isolated layer and indistinctively lower than the control with the grafting seedlings growth. Exogenous NAA treatment significantly increased the relative expression of CmFe-SOD， CmCu-Zn-SOD， CmMn-SOD and CmPPO except CmPOD ， and the trend of changes is basically consistent with the enzyme activities changes. The comprehensive analysis showed that the exogenous NAA application shortened the time of grafted healing， induced the expression of key enzyme genes that involved in graft union and increased the related enzyme activities， which promoted the graft healing process of grafting melon seedlings.

Key words： Melon; Graft healing; Naphthalene acetic acid; Protective enzyme; Gene expression

甜瓜（Cucumis melo L.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis）一年生蔓性草本植物，在世界園藝生產(chǎn)中一直占有重要地位，具有很高的經(jīng)濟價值[1]。但在甜瓜生產(chǎn)中出現(xiàn)的土傳病害和連作障礙嚴重等問題已成為制約甜瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要原因。由于輪作困難、藥劑防效不理想且易污染環(huán)境、抗病育種周期長等方法的局限，甜瓜嫁接技術(shù)已成為生產(chǎn)中防治土傳病害和連作障礙的有效方法之一。此外，嫁接可通過切斷和重連來自不同植物物種或品種的維管束來應(yīng)對非生物和生物脅迫的抗性，提高植株抗逆性和抗病性，改變植株的發(fā)育進程等，從而使其增產(chǎn)、提高果實品質(zhì)或改變植株大小[2-4]。

嫁接愈合是植物的器官、組織或細胞相互影響、相互作用結(jié)合成一個有機整體的過程。盡管嫁接愈合過程所分的階段及所需時間因不同品種、年齡、嫁接方法及嫁接時間等的不同而有差異，但砧穗間所發(fā)生的愈合過程卻基本相同。大致分為3個過程：接穗和砧木間的組織黏連及隔離層的形成;愈傷組織的形成;接穗和砧木間維管束橋的重連[5]。在植物嫁接愈合過程中，愈傷組織的分化產(chǎn)生及其延伸速度是決定形成愈傷組織時間長短的一個關(guān)鍵因素，而植物生長調(diào)節(jié)劑在嫁接愈合過程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。在生產(chǎn)實踐中，人們常用生長調(diào)節(jié)劑來處理植物的接穗或砧木，發(fā)現(xiàn)它們有促進愈合、提高成活率的作用[6]。萘乙酸（α-Naphthalene acetic acid，NAA）是一種生長素類的植物生長調(diào)節(jié)劑，其通過使細胞壁松弛、促進RNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)合成從而促進細胞生長。外源施加濃度較高（≥10-7 mol·L-1）的NAA，對根部生長有抑制作用，而對不親和的嫁接體來說，其影響更大，但適宜的NAA濃度能有效促進嫁接成活。趙宇瑛等[7]對黃瓜子葉進行組織培養(yǎng)研究表明，極低濃度的NAA即能誘導(dǎo)大量愈傷組織，在0.05～0.10 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，隨NAA濃度的提高，出愈率提高，愈傷組織增殖加快。馬慶等[8]在黃瓜嫁接研究中發(fā)現(xiàn)，外源施用40 mg·L-1的NAA處理后嫁接苗成活率最高，并能提高幼苗品質(zhì)。但NAA的應(yīng)用對嫁接苗內(nèi)部生理的響應(yīng)機制以及調(diào)控作用仍不明確。因此，筆者以薄皮甜瓜‘銀泉一號為試材，以外源施用40 mg×L-1 NAA為處理，蘸取清水為對照，用石蠟切片技術(shù)，分析外源施用NAA對薄皮甜瓜嫁接苗愈合過程中組織變化的影響，確定薄皮甜瓜嫁接苗愈合的關(guān)鍵時期。其次，利用生理生化指標和qRT-PCR技術(shù)，明確外源施用NAA對薄皮甜瓜嫁接苗愈合關(guān)鍵時期主要相關(guān)酶活性及相關(guān)基因表達的影響，以期能夠進一步解析外源NAA調(diào)控甜瓜嫁接愈合的生理及分子機制，為提高甜瓜嫁接效率提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以薄皮甜瓜品種‘銀泉一號為接穗（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供），白籽南瓜品種‘圣砧一號為砧木（沈陽圣地亞農(nóng)業(yè)科技有限公司提供）。待接穗1葉1心，砧木子葉展開時，采用頂端貼接法進行嫁接。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2018年4月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北山科研基地18號日光溫室嫁接間進行。在嫁接過程中以接穗蘸取清水為對照（CK），蘸取40 mg×L-1的NAA溶液為處理（NAA），對照和外源NAA處理的嫁接苗管理方式一致。于嫁接后第1天開始取樣，取嫁接接口處0.5～1.0 cm處放于配好的FAA固定液（含70%無水乙醇、福爾馬林和冰乙酸）中，取至嫁接后第10天，將樣品進行橫切進行石蠟切片觀察。取長勢健壯的嫁接苗嫁接口處約0.2 g莖段，去離子水沖洗，吸水紙擦干，迅速放入液氮冷凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用，3次重復(fù)。

1.3 方法

1.3.1 石蠟切片的制作 參照葉寶興等[9]的方法處理樣品，使用Lecia RM 2245輪轉(zhuǎn)式切片機制作石蠟切片，厚度10 ?m，甲苯胺藍染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織細胞結(jié)構(gòu)變化并照相。

1.3.2 SOD、POD、PAL、PPO酶活性測定 通過石蠟切片觀察后，篩選出關(guān)鍵時期，取出相對應(yīng)的樣品，進行相關(guān)酶活性的測定（以FW計）。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑法測定[10]，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性采用紫外分光光度法測定[11];過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[12];多酚氧化酶（PPO）活性采用鄰苯二酚氧化法測定[13]。

1.3.3 實時熒光定量PCR分析 RNA提取試劑盒由康為世紀提供的超純RNA提取試劑盒（Ultrapure RNA Kit），其詳盡操作步驟參考說明書。并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）提供的方法進行cDNA合成。熒光定量反應(yīng)在定量PCR儀Jena上進行。利用熒光定量試劑盒（DRR041A，TANGEN）檢測各個基因的表達量，步驟參照試劑盒說明。

PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，收集熒光信號;50～60 ℃ 6 s，生成溶解曲線。各引物序列見表1。每個樣品做3次重復(fù)，計算各個基因的相對表達量。

采用Microsoft Excel 2007處理原始數(shù)據(jù)及繪圖，采用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜愈合處石蠟切片觀察

嫁接后第2天，在砧木和接穗相連接的區(qū)域可觀察到1個染色較深的薄層。由圖2-A、圖2-F可知，對照和外源NAA處理均產(chǎn)生隔離層，隔離層的產(chǎn)生起到一種保護作用，防止接口處水分和營養(yǎng)物質(zhì)的過量散失?？梢?，外源施用NAA并沒有促進隔離層的形成。隨著嫁接苗管理天數(shù)的增加，隔離層漸漸消失，接口處顏色變淺，形成愈傷組織。外源NAA處理的嫁接苗在第5天形成愈傷組織（圖2-G），而對照植株愈傷組織形成則發(fā)生在第6天（圖2-C）。在第8天時，外源NAA處理的嫁接苗形成維管束（圖2-I），而對照植株新的維管束形成發(fā)生在第9天（圖2-E）。維管束的重新連接預(yù)示著嫁接愈合過程的完成?？梢?，外源施用NAA能夠促進愈傷組織的形成，從而使愈合進程提前。

2.2 嫁接甜瓜愈合過程關(guān)鍵時期相關(guān)酶的活性變化

由圖3-A分析得知，隨著嫁接管理時間的延長，外源NAA處理和對照嫁接苗接口處的SOD酶活性均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，且在愈傷組織形成期達到最高值。外源NAA處理后，SOD活性在3個關(guān)鍵時期均比對照高，且在隔離層和愈傷組織形成期均顯著高于對照?？梢?，外源NAA處理后，SOD酶活性增高，有效抑制了活性氧給植物體造成的傷害，從而促進薄皮甜瓜嫁接苗的愈合。

由圖3-B可知，外源NAA處理后，POD酶活性在愈傷組織和維管束形成期高于對照。且在愈傷組織形成期，POD活性顯著高于對照，活性達最高值（3 718 U·g-1·h-1）。而對照在維管束形成時期POD活性最高（3 183 U·g-1·h-1）。外源NAA處理后，POD活性較對照提前一個時期達到最高值，此時木質(zhì)化程度最大?？梢姡庠碞AA處理能夠加快薄皮甜瓜嫁接苗的愈合速度。

由圖3-C分析得知，外源NAA處理后，PAL酶活性在愈合過程3個關(guān)鍵時期均高于對照。除愈傷組織形成期外，PAL酶活性均顯著高于對照，并在維管束形成時期達到最高值（306.67 U·g-1·h-1）。PAL酶活性升高可促進木質(zhì)素合成和維管束的形成?？梢?，外源NAA處理后有利于維管束的形成，進而促進薄皮甜瓜嫁接苗的愈合過程。

由圖3-D可知，外源NAA處理和對照嫁接苗的PPO酶活性均呈現(xiàn)上升的趨勢。在隔離層時期，外源NAA處理的嫁接苗PPO酶活性顯著高于對照。分析原因可能是外源NAA處理更利于砧木與接穗接口處酚類物質(zhì)氧化成活性醌，從而保護嫁接口免受傷害。而在愈傷組織和維管束形成期，外源NAA處理的嫁接苗PPO酶活性低于對照，但差異不顯著。可見，外源NAA處理使隔離層存在的時間短于對照，更有利于嫁接苗愈合。

2.3 甜瓜嫁接愈合過程關(guān)鍵時期關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達量變化

生理數(shù)據(jù)檢測結(jié)果顯示，外源NAA處理與對照嫁接苗的酶活性存在一定的差異，為了初步解析導(dǎo)致這種差異的原因，分析了愈合過程中關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達特性。從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.cucurbitgenomics.org/feature）中得到3個超氧化物歧化酶基因（CmFe-SOD、CmMn-SOD、CmCu-Zn-SOD）、1個過氧化物酶基因（CmPOD）和1個苯丙氨酸解氨酶基因（CmPAL），1個多酚氧化酶基因（CmPPO），并設(shè)計其特異引物（表1），分析了以上基因在甜瓜嫁接愈合過程關(guān)鍵時期的表達特性。

由圖4-A～C可知，外源NAA處理后，3個SOD酶基因（CmFe-SOD、CmMn-SOD和CmCu-Zn-SOD）在各個時期的表達量均高于對照，且外源NAA處理使CmFe-SOD和Cm-Cu-Zn-SOD表達量在愈傷組織形成時期顯著高于對照，分別為對照的3.03和3.57倍，但對CmMn-SOD表達量影響不顯著。

由圖4-D可知，對照嫁接苗CmPOD表達量在3個關(guān)鍵時期均高于外源NAA處理，并且在愈傷組織形成期表達量顯著高于NAA處理。對照嫁接苗CmPOD表達量趨勢呈先升高后降低的趨勢，在第2個時期達到最高值為0.67。而外源NAA處理后其表達量變化呈下降趨勢，并在隔離層和愈傷組織形成期顯著低于對照?？梢?，外源NAA處理后，沒有顯著誘導(dǎo)CmPOD基因的表達。

由圖4-E分析得知，在嫁接愈合過程中，CmPAL表達量變化呈先下降后上升的趨勢。但是，外源NAA處理的嫁接苗CmPAL表達量在愈傷組織形成期和維管形成期均顯著高于對照，分別為對照的3.02和4.02倍?？梢?，外源NAA處理顯著誘導(dǎo)了CmPAL在愈傷組織形成期和維管束形成期表達。

由圖4-F分析可知，在嫁接苗愈合過程中，CmPPO表達量變化呈現(xiàn)下降的趨勢。在隔離層形成期，外源NAA處理的嫁接苗CmPPO表達量顯著高于對照，為對照的2.69倍。而在愈傷組織形成期和維管束形成期，外源NAA處理的嫁接苗CmPPO表達量低于對照，但其差異不顯著?？梢姡庠碞AA處理可顯著誘導(dǎo)CmPPO在隔離層形成期表達。

3 討論與結(jié)論

3.1 外源施用NAA對甜瓜嫁接愈合過程中組織學(xué)的影響

已有研究表明，外源施用生長素可促進中柱鞘細胞形成愈傷組織，引起側(cè)根的形成[14-15]。而NAA是一種合成的生長素類似物，有促進細胞的生長和促進植物體愈合的作用，并且適宜的NAA濃度能有效的促進嫁接成活率[16-17]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，外源施用40 mg×L-1 NAA后，使愈傷組織形成時期較對照提前1 d，從而促進了維管束的連接，有效的促進了愈合過程。這與Lu和Song[18]的試驗結(jié)果一致，外源施加植物激素可加快植物的愈合速率。

3.2 外源施用NAA對甜瓜嫁接愈合過程中關(guān)鍵酶及相關(guān)基因表達的影響

在嫁接愈合進程中，兩種植物組織結(jié)合在一起，在愈合部位發(fā)生許多生理生化和結(jié)構(gòu)過程變化[19-21]。超氧化物歧化酶（SOD）是植物體內(nèi)清除自由基的最關(guān)鍵的酶類之一。本試驗結(jié)果表明，嫁接初期，由于傷口的存在破壞了膜結(jié)構(gòu)，活性氧增加，為了清除自由基對膜的破壞，抑制膜脂過氧化，維護膜的結(jié)構(gòu)和功能，在嫁接初期，SOD酶活性呈上升趨勢，在愈傷組織形成期活性最高，隨著嫁接接口的愈合，其活性逐漸下降，這與陳紅等[22]和馮金玲等[23]研究結(jié)果一致。并發(fā)現(xiàn)，外源施用NAA后SOD酶活性在愈合過程3個關(guān)鍵時期均高于對照，表明NAA的施用有效地清除了活性氧給嫁接口造成的傷害，促進甜瓜的愈合進程。POD在砧穗交流中是必需的，其活性變化趨勢與SOD酶活性變化趨勢相似，均呈先上升后下降的趨勢[24]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源施用NAA后，POD活性在愈傷組織形成期達到最高值，且顯著高于對照。這與蘇媛等[25]對黃瓜嫁接愈合的研究結(jié)果一致，即POD活性變化與嫁接愈合過程中愈傷組織的形成有關(guān)。楊冬冬等[26]對西瓜嫁接愈合的研究結(jié)果顯示，POD活性的增加與木質(zhì)素的合成密切相關(guān)。本試驗中外源NAA處理使POD活性顯著增加可能是其促進嫁接接合部愈合的重要原因之一。PAL酶是苯丙類代謝的限速酶和關(guān)鍵酶，參與愈傷組織細胞和管狀分子的分化以及木質(zhì)素的合成，主要分布在近表皮的細胞和維管組織中[27-28]。PAL酶是嫁接體組織發(fā)育和功能重建的重要指標。另外，細胞供能的情況也可根據(jù)PAL的活性高低來反映，隨著植物嫁接愈合過程的發(fā)展，植物會供給大量的能量，而PAL酶活性的增高也為此提供了證據(jù)[29]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源NAA處理和對照在維管束形成時期的PAL酶活性均上升達到最高值。并且，外源NAA處理使PAL酶活性顯著高于對照?？梢?，外源施用NAA處理能夠使嫁接口的木質(zhì)化程度升高，更有利于甜瓜嫁接苗愈合。PPO酶主要參與植物細胞壁木質(zhì)素的合成，并且能夠氧化體內(nèi)酚類物質(zhì)[30]。張紅梅等[31]發(fā)現(xiàn)木質(zhì)化程度越高，PPO活性越高，砧木和接穗間嫁接口隔離層存在時間就越長，從而影響嫁接愈合的成活。通過本試驗結(jié)果可以看出，外源NAA處理后，在隔離層形成時期，PPO活性顯著高于對照，表明其更有利于形成隔離層，保護受傷的嫁接口。而在之后的兩個時期低于對照，是因為隔離層消失，更好的形成愈傷組織和維管束，有利于提高愈合速度及成活率。

為了進一步解析甜瓜嫁接愈合過程中關(guān)鍵酶活性的變化原因，我們從轉(zhuǎn)錄水平上分析了愈合關(guān)鍵時期關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達。從NCBI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中，我們找到了6個關(guān)鍵酶相關(guān)的基因，分別是CmFe-SOD、Cm-Cu-Zn-SOD、CmMn-SOD、CmPAL、CmPOD、CmPPO。外源NAA處理后，CmFe-SOD、Cm-Cu-Zn-SOD、CmMn-SOD、CmPAL表達量均高于對照，其變化趨勢與酶活性變化趨勢基本一致，并且CmFe-SOD、Cm-Cu-Zn-SOD和CmPAL在愈傷組織形成期均顯著高于對照，CmPPO在隔離層形成時期顯著高于對照，且變化趨勢也與酶活性變化趨勢一致?？梢?，外源NAA處理是通過誘導(dǎo)甜瓜嫁接愈合過程中關(guān)鍵酶相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達進而影響其相關(guān)酶活性變化。而CmPOD表達量的變化趨勢與酶活性相反，其原因可能是POD酶的活性并不受CmPPO轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控，但有待于進一步研究。

目前，已有研究報道，外源施用植物激素可促進植物的愈合過程。本試驗結(jié)果表明，外源施用NAA通過誘導(dǎo)愈傷組織形成期的關(guān)鍵酶基因（CmFe-SOD、CmCu-Zn-SOD、CmPAL）轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)表達，提高其酶活性，進而促進了甜瓜嫁接苗的愈合進程。但是，有關(guān)外源NAA誘導(dǎo)愈合過程中關(guān)鍵酶基因表達的具體分子機制尚不明確。甜瓜嫁接體愈合的過程十分復(fù)雜，涉及很多生理生化代謝過程，用傳統(tǒng)方法分析代謝物間的相互作用較困難。因此，在未來的研究中，可進一步應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)及轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9）等手段來揭示調(diào)控甜瓜嫁接愈合的關(guān)鍵因子，為能夠系統(tǒng)闡明嫁接愈合的生理及分子化機制提供理論基礎(chǔ)。

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