‘海爾特茲’樹莓組織培養(yǎng)及其葉柄再生體系的建立

劉麗 高登濤 魏志峰 郭俊英 李秋利 劉軍偉 朱會調(diào)

摘 ? ?要：為研究樹莓的工廠化育苗技術(shù)，提高樹莓育苗質(zhì)量和效率，以樹莓品種‘海爾特茲帶腋芽的莖段為試驗材料，通過對其腋芽初代培養(yǎng)、莖段增殖、葉柄不定芽和根的誘導等過程中植物生長物質(zhì)合理組合，及防止莖段褐化的最適pH值進行篩選，建立‘海爾特茲樹莓組織培養(yǎng)及其葉柄再生體系。結(jié)果表明，腋芽誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA，萌芽率100%;莖段最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 ?mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，pH值為5.70，增殖系數(shù)為5.0;誘導葉柄產(chǎn)生愈傷組織再生不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-1 TDZ +1.0 mg·L-1 IBA，其愈傷組織誘導率為100%，不定芽再生率為53%;幼苗最佳生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA，生根率達95%。

關(guān)鍵詞：樹莓;‘海爾特茲;葉柄;愈傷組織

中圖分類號：Q813.1+2;S663.2 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.005

Abstract：In order to improve the quality and efficiency of industrial seedling cultivation of raspberry， stem segments with axillary buds of the raspberry cultivar 'Heritage' were used as experiment material， the regeneration system of leaf petioles was established through ?screening of the reasonable plant growth substances combination in the process of axillary bud primary culture， stem segment proliferation， petiole adventitious bud and root induction， and the optimum pH value to prevent stem segment browning. The results showed that the optimum medium for axillary bud induction was MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA， and the germination rate was 100%; the optimum medium for stem segment proliferation was MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA， and the pH value was 5.70， which the multiplication coefficient was 5.0; the optimum medium for petiole callus regeneration was MS+2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA， which the induction rate of callus was 100%， and the regeneration rate of adventitious bud was 53%; the optimum medium for rooting was 1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA， and the rooting rate was 95%.

Key words： raspberry; 'Heritage'; petiole; callus

樹莓（Rubus idaeus）是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）多年生落葉灌木型果樹，其果實營養(yǎng)豐富，除含有豐富的有機酸、氨基酸和維生素外，還含有鞣化酸、黃酮類物質(zhì)和SOD等，具有很好的保健功能，被稱為“第三代水果”[1-5]。近幾年，我國樹莓發(fā)展呈逐年增長趨勢，其生產(chǎn)量由2012年的1萬t發(fā)展到2015年的2.5萬t[6]。

‘海爾特茲是引自美國紐約州的雙季樹莓品種，果實口味獨特，品質(zhì)優(yōu)良，色澤鮮艷，營養(yǎng)豐富，硬度大，抗病蟲能力強，栽培容易，管理簡單，經(jīng)濟效益顯著[7-8]，是目前市場上推廣相對較多的一個品種。

目前，我國樹莓種苗繁殖生產(chǎn)上多采用根蘗、扦插、壓條等技術(shù)，不僅苗木繁殖系數(shù)低、易受季節(jié)影響，同時易積累病毒，導致品質(zhì)變劣、產(chǎn)量下降，造成生產(chǎn)上重大的經(jīng)濟損失[9-10]。國外的樹莓生產(chǎn)上多采用組培苗甚至脫毒苗建園，組培苗根系發(fā)達、生長健壯，連續(xù)產(chǎn)量高，無病蟲害等優(yōu)點，有利于樹莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

本試驗對‘海爾特茲樹莓組培及其葉柄再生體系建立的條件進行探討和優(yōu)化，為建立工廠化育苗體系及進一步的倍性育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試樹莓品種為‘海爾特茲，2015年栽種于中國農(nóng)業(yè)科學院小漿果種質(zhì)資源圃，于2018年春季剪取其新萌發(fā)枝條裝入冰盒帶回實驗室。

1.2 方 法

試驗所用MS培養(yǎng)基均由30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂組成。

1.2.1 消毒滅菌 ? ?截取‘海爾特茲樹莓新發(fā)枝條上端15 cm，剪去葉片，用洗潔精洗凈，在流水下沖洗2～3 h;在超凈工作臺上，將莖段在75%酒精中消毒30 s，再置于0.1%升汞中消毒5 min，無菌水沖洗4～5次，放在濾紙上，將材料剪成1 cm左右?guī)а壳o段（芽下部莖稍長些）供接種使用。

1.2.2 初代培養(yǎng) ? ?將接種莖段分別接種于含不同植物生長物質(zhì)的MS培養(yǎng)基中，pH值為5.80。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)設(shè)4個處理：1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IAA;每個處理10瓶，每瓶接種3個外植體。接種30 d后調(diào)查腋芽萌芽情況，統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.2.3 防褐化處理 ? ?將經(jīng)過初代培養(yǎng)產(chǎn)生的莖段分別接種于不同pH值的MS培養(yǎng)基中，設(shè)3個處理，pH值分別為5.80，5.75，5.70。每個處理10瓶，每瓶接種3個外植體。接種15 d后調(diào)查褐化情況，統(tǒng)計褐化率。1.2.4 莖段增殖 ? ?經(jīng)初代培養(yǎng)產(chǎn)生的莖段，需進行增殖培養(yǎng)。將萌發(fā)后的幼嫩無菌苗剪取成1～2 cm轉(zhuǎn)移到添加不同植物生長物質(zhì)的MS培養(yǎng)基中，pH值為5.70，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)設(shè)8個處理：1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.1g·L-1 IBA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 IBA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IBA。每個處理10瓶，每瓶3株無菌苗，培養(yǎng)30 d后觀察不定芽分化和生長情況，計算增殖系數(shù)。

1.2.5 葉柄不定芽誘導 ? ?經(jīng)過初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽長至3 cm左右，在無菌工作臺上取下葉柄，葉柄剪至0.5 cm長，分別接種于6種添加不同植物生長物質(zhì)的MS培養(yǎng)基中，pH值為5.80。植物生長物質(zhì)設(shè)6個處理：2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IAA;2.0 mg·L-1 TDZ+0.5 mg·L-1 IAA;2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA;2.0 mg·L-1 TDZ+0.5mg·L-1 IBA;1.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IAA;1.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA。每個處理6瓶，每瓶放置5個剪好的葉柄。培養(yǎng)40 d后觀察愈傷形成和出芽生長情況。

1.2.6 根的誘導 ? ?以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，pH值為5.80。將誘導產(chǎn)生的>2 cm的不定芽接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基共設(shè)計3種不同濃度的IBA組合，分別為1.0，0.7，0.5 mg·L-1。每個處理10瓶，每瓶接種3株不定芽，培養(yǎng)30 d后觀察并記錄生根情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel2007對數(shù)據(jù)進行計算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長物質(zhì)組合對‘海爾特茲腋芽出芽的影響

‘海爾特茲樹莓莖段初代培養(yǎng)效果詳見圖1和表1。由表1可知，當初代培養(yǎng)MS中6-BA為1.0 mg·L-1時，‘海爾特茲樹莓莖段萌芽率隨著NAA和IAA濃度的增加而增加，以1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA濃度的植物生長物質(zhì)組合效果最佳，萌芽率可達到100%。

2.2 不同pH值對莖段褐化率的影響

由表2可知，經(jīng)過初代培養(yǎng)萌芽的腋芽接種在不同pH值MS培養(yǎng)基中均出現(xiàn)不同程度褐化，其褐化率隨著pH值的降低而降低，在pH值為5.70的MS培養(yǎng)基中褐化率最低，為16.7%。

2.3 不同植物生長物質(zhì)組合對‘海爾特茲莖段增殖的影響

由表3可知，在8個不同生長物質(zhì)組合中，‘海爾特茲莖段的增殖培養(yǎng)效果以0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA組合處理最好，其增殖系數(shù)為5.0。

2.4 不同植物生長物質(zhì)組合對‘海爾特茲葉柄愈傷組織誘導和不定芽形成的影響

葉柄在愈傷組織誘導培養(yǎng)基中兩端逐漸膨大（圖2），不同植物生長物質(zhì)組合處理均可產(chǎn)生愈傷（圖3），即各處理愈傷組織誘導率均為100%（表4），但有些處理葉柄膨大成愈傷組織后逐漸變褐不能產(chǎn)生再生芽，故各處理不定芽（圖4）再生率不同，6個含有不同濃度的植物生長物質(zhì)組合處理中，以2.0 mg·L-1TDZ +1.0 mg·L-1IBA處理愈傷組織不定芽再生率最高，為53%（表4）。

2.5 不同濃度的植物生長物質(zhì)對‘海爾特茲幼苗生根的影響

將生長至2～3 cm的健壯幼苗剪下接種到生根培養(yǎng)基中，生根效果良好（圖5）。由表5可知，隨著培養(yǎng)基中IBA濃度的增加，‘海爾特茲幼苗生根率呈先升后降的趨勢，在IBA為0.7 mg·L-1時生根率最高，達到95%。

3 結(jié)論與討論

褐化、菌類污染和玻璃化現(xiàn)象一直是組織培養(yǎng)中的難題[9]。褐化是由于酚類物質(zhì)被多酚氧化酶（PPO）氧化成醌類物質(zhì)，抑制了相關(guān)酶的活性，從而阻礙培養(yǎng)材料的正常生長，甚至導致培養(yǎng)物死亡[10]。配制培養(yǎng)基時，適當?shù)亟档蚿H值可以降低多酚氧化酶活性和底物利用率，進而抑制褐變，升高pH值則明顯加重褐變[11]。金堅敏[12]在水稻的體細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，pH值為 4.5～5.0 的MS培養(yǎng)基可使愈傷組織保持良好的生長狀態(tài)，而pH值為5.5～6.0時，愈傷組織發(fā)生嚴重褐化。在本試驗中，‘海爾特茲的增殖培養(yǎng)過程中褐化率隨著培養(yǎng)基pH值的降低而降低，當pH值為5.70時，其褐化率為16.7%，褐化問題得到有效緩解，而有關(guān)pH值繼續(xù)降低是否有助于其褐化率進一步降低的問題尚需討論，但在本試驗中因培養(yǎng)基pH值低于5.70時不易凝固，故pH值最低定為5.70。

李艷霞[13]以樹莓品種‘波魯?shù)虑o尖為材料，莖尖誘導最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA+0.5 mg·L-1 GA3，建立了離體培養(yǎng)再生體系。潘菊等[14]以帶腋芽莖段為外植體，研究了樹莓的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)，得出樹莓的最佳誘導培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+20 g·L-1白糖。本試驗側(cè)重于對葉柄進行再生培養(yǎng)，建立了‘海爾特茲完善的組培再生體系，為工廠化育苗和在組培再生基礎(chǔ)上的倍性育種奠定了基礎(chǔ)，其腋芽誘導最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA +1.0 mg·L-1 IAA，萌芽率100%;莖段最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，增殖系數(shù)為5.0;誘導葉柄產(chǎn)生愈傷組織再生不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-1 TDZ +1.0 mg·L-1 IBA ，其愈傷組織誘導率為100%，不定芽再生率為53%;幼苗最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA，生根率達95%。

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