幾種醋酸菌混合發(fā)酵對果醋品質(zhì)的影響研究

鄭顯義

(內(nèi)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641000)

果醋是以水果或果品加工下腳料為原料，經(jīng)發(fā)酵釀制而成的一種營養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸性調(diào)味品[1]。果醋不但味美香濃，而且營養(yǎng)豐富，具有一定的保健功能。果醋中含有大量的有機(jī)酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，還有人體必需的氨基酸，它能夠在一定程度上緩解疲勞、開胃消食、解酒保肝、抗菌消炎、調(diào)節(jié)酸堿平衡，還有研究表明果醋可以降低血脂和膽固醇，預(yù)防動脈硬化和心腦血管疾病的發(fā)生[2]。

在國內(nèi)，目前還沒有針對果醋的專門酵母菌，而且釀造果醋使用的菌種比較單一，這會大大影響產(chǎn)品的風(fēng)味，產(chǎn)品質(zhì)量也不穩(wěn)定[3-5]。而多菌共酵可以有效改善產(chǎn)品的風(fēng)味，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性[6]。實驗研究表明，從自然發(fā)酵的酒糟或果酒液中分離、出來的酵母菌菌種檢出率較高，因其生長環(huán)境與釀酒環(huán)境相似[7]。因此，本實驗從草莓表皮及果肉中分離、篩選出優(yōu)良的醋酸菌株，并與工業(yè)上常用的菌株共酵[8,9]，并對發(fā)酵的最佳條件進(jìn)行摸索，進(jìn)行果醋釀造。

1 材料與方法

1.1 材料

草莓、PDA培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基：市售。

1.2 設(shè)備

SHL207型ACA榨汁機(jī) 北美電器(四川)有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 四川飛利浦家用電器有限公司；SZH-B型水浴恒溫振蕩器、KDZX-40B型全立式自動控溫高壓滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；pH計 德國賽多利斯股份有限公司；CKX31-A12PHP型顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 草莓中酵母菌的篩選[10-13]

將市售草莓用無菌水簡單清洗，取樣品10 g，搗碎后用無菌水依次稀釋至10-1～10-6，振蕩培養(yǎng)10 min，吸取 0.1 mL上清液于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng) 48 h，之后在培養(yǎng)基上選擇具有酵母菌典型菌落特征的菌落進(jìn)行劃線分離并鏡檢分純，直至顯微鏡觀察為純菌落。將分純的菌落移植在PDA斜面上培養(yǎng)28 ℃后，于4 ℃保存。將分離到的菌株進(jìn)行YEPD斜面活化，培養(yǎng)10 h后，以10%的量接種到含糖20%的YEPD培養(yǎng)液中，于振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)7 d，通過感官比較選出酒味濃郁并有特征香味的菌株。將菌種活化擴(kuò)大培養(yǎng)后，再用10%的接種量接種到10 mL的YEPD液體試管培養(yǎng)基中，然后放入杜氏管。在培養(yǎng)箱中于30 ℃靜置培養(yǎng)，每12 h觀察一次產(chǎn)氣情況，并記錄氣泡高度。根據(jù)實驗結(jié)果，篩選出發(fā)酵快、性能好、生長旺盛的菌株。

1.3.2 草莓中酵母菌的性能測試

1.3.2.1 溫度耐受性

選擇糖度為18 °Bx的培養(yǎng)液，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min，將上一階段篩選出來的酵母菌以10%的接種量，分別接種在25，30，35 ℃溫度條件下培養(yǎng)5 d，每隔24 h取樣蒸餾測發(fā)酵酒度。

1.3.2.2 產(chǎn)酸速度[14,15]

按10%的接種量將菌種接入酒精含量為12%的生長培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)，每天測定發(fā)酵液的醋酸含量，當(dāng)醋酸含量保持恒定時結(jié)束發(fā)酵。

1.3.2.3 SO2耐受性試驗[16]

向草莓汁中添加亞硫酸鈉，使培養(yǎng)液中SO2的濃度達(dá)到60，90，120，150，180，210 mg/L，糖度為18 °Bx，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min，以10%的接種量于30 ℃培養(yǎng)5 d，每天固定時間取樣蒸餾測發(fā)酵酒度。

1.3.2.4 酒精度耐受性[17]

以10%的接種量將菌種加入酒精含量為6%、8%、10%、12%、14%的生長培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min，30 ℃培養(yǎng)72 h，在400 nm波長處測OD值。

1.3.3 多菌發(fā)酵試驗設(shè)計

1.3.3.1 發(fā)酵菌株選擇

將發(fā)酵菌種分為A，B，C 3組，每組的菌種組成如下：A(工業(yè)上常用的食醋發(fā)酵醋酸菌AS1.41和滬釀1.01)；B(草莓中篩選出來的優(yōu)質(zhì)醋酸菌株ST-03和ST-11-1)；C(將A，B 2組共4株菌株混合，即食醋發(fā)酵醋酸菌AS1.41、滬釀1.01、ST-03和ST-11-1)。

在榨好的草莓汁中分別加入經(jīng)過活化的固定化醋酸菌A，B和C，接種量均為10%，進(jìn)行醋酸發(fā)酵。發(fā)酵過程中，控制初始發(fā)酵溫度為30～35 ℃，空氣流量比為1∶0.2，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min；中期旺盛期溫度為38～40 ℃，空氣流量比為1∶0.4，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min；發(fā)酵后期為防止乙酸進(jìn)一步氧化，將溫度降為35 ℃，空氣流量比為1∶0.2，發(fā)酵時間為2 d, 每24 h測定發(fā)酵液中酸度，當(dāng)酸度不再上升時終止發(fā)酵。發(fā)酵好的草莓醋經(jīng)過濾后, 調(diào)整酸度為5%～6%，95 ℃殺菌5 min后即為成品[18,19]。

1.3.3.2 發(fā)酵的最佳條件[20-24]

根據(jù)1.3.3.1中篩選出來的菌進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，然后進(jìn)行正交試驗，確定最佳發(fā)酵條件，正交試驗設(shè)計見表1。

表1 草莓果醋發(fā)酵條件正交試驗設(shè)計

1.3.3.3 感官評價

挑選15位有經(jīng)驗的感官分析人員，對其進(jìn)行培訓(xùn)，并讓他們對發(fā)酵所得草莓果醋的色澤、澄清度、氣味和口感進(jìn)行打分，每個項目的滿分為25分，總分為100分。去掉最高分和最低分后取算術(shù)平均值，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 草莓果醋評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與討論

2.1 草莓中醋酸菌篩選結(jié)果

通過分純劃線等操作，根據(jù)菌株的顏色、形態(tài)和產(chǎn)氣情況等因素，篩選出兩株菌，分別為ST-03和ST-11-1。現(xiàn)將兩株菌混合，做如下性能測試。

2.1.1 溫度耐受性試驗結(jié)果

圖1 草莓中醋酸菌溫度耐受性試驗

由圖1可知，在25～35 ℃溫度范圍內(nèi)，酵母菌的最佳生長溫度為30 ℃。在35 ℃條件下，前3 d酒精度增長呈正常的上升趨勢，從第4天開始基本停止生長，推測是較高的溫度抑制了醋酸菌的酶活。在25 ℃條件下，隨著溫度的升高，醋酸菌的產(chǎn)酒精能力逐漸增強(qiáng)。但較低的溫度會使酶活力受到抑制，因此在此溫度下，醋酸菌的產(chǎn)酒率較低。因此，盡管在25 ℃的條件下，醋酸菌的產(chǎn)酒量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加仍然在上升，但菌株的酶活不如30 ℃。

2.1.2 產(chǎn)酸速度結(jié)果

圖2 草莓醋酸菌的醋酸產(chǎn)生速度

由圖2可知，在發(fā)酵前4 d，ST-11-1的產(chǎn)酸速度較慢，ST-03的產(chǎn)酸速度相對較快，而將兩者混合的產(chǎn)酸速度與ST-03單菌的產(chǎn)酸速度相差不多。從第5天開始，兩株菌的醋酸產(chǎn)量差距逐漸縮小，到第6天與第7天幾乎已經(jīng)重合，但兩株菌混合的效果仍然稍微高一些。綜上，將兩株菌混合，即ST-03和ST-11-1組合的產(chǎn)酸能力最佳。

2.1.3 SO2耐受性試驗結(jié)果

圖3 草莓醋酸菌的SO2耐受性

由圖3可知，隨著SO2添加量的增加，酒精產(chǎn)率逐漸降低，但影響不大，只是略微下降，說明草莓中篩選出的兩株醋酸菌對SO2具有較好的耐受性。從草莓果醋的顏色來看，隨著 SO2添加量的增加，果醋由開始的暗紅色逐漸變淡，說明SO2的量增多，漂白效果逐漸顯現(xiàn)。雖然兩株菌有一定的SO2耐受性，但控制SO2的量在90 mg/L以下較好。

2.1.4 酒精度耐受性

圖4 草莓醋酸菌的酒精度耐受性

由圖4可知，酒精含量為6%時已經(jīng)對草莓醋酸菌產(chǎn)生抑制作用，并且這種抑制作用隨著酒精含量的增加而增加，酒精含量達(dá)到10%時基本已經(jīng)達(dá)到酵母菌的耐受極限。酒精雖然是醋酸菌發(fā)酵過程中的產(chǎn)物，但對于細(xì)胞本身來說會抑制醋酸菌的生長。因此在發(fā)酵過程中，建議將酒精度控制在6%以下。

2.2 發(fā)酵菌株選擇結(jié)果

根據(jù)感官評分，對3種醋酸菌組合進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

由表3可知，總評分最高的是C組，即：將食醋發(fā)酵醋酸菌AS1.41、滬釀1.01、ST-03和ST-11-1混合發(fā)酵的效果最佳。因此，在下一步實驗中，將4種菌株混合，探究發(fā)酵的最佳條件。

表3 不同醋酸菌發(fā)酵感官評價表

2.3 發(fā)酵最佳條件

根據(jù)正交表的設(shè)計，結(jié)合感官評分表，對草莓果醋的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行摸索，得到的結(jié)果見表4。

表4 不同發(fā)酵條件感官評價表

由表4可知，以感官評分為衡量指標(biāo)，在多菌共酵過程中，影響發(fā)酵質(zhì)量的主次因素順序為A>B>C，即溫度>時間>接種量；其中，最優(yōu)組合為A2B3C1，即發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為7 d，接種量為8%。

3 結(jié)論

通過在新鮮草莓表皮及果肉中篩選，得到兩株具有良好發(fā)酵潛力的醋酸菌ST-03和ST-11-1，并對兩株菌的溫度耐受性、產(chǎn)酸速度、SO2耐受性以及酒精度耐受性進(jìn)行了測試。將它們與傳統(tǒng)工業(yè)食醋發(fā)酵醋酸菌AS1.41和滬釀1.01混合進(jìn)行多菌共酵制作草莓果醋，確定最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間7 d，接種量8%。所制作的草莓果醋具有澄清度高、風(fēng)味及口感優(yōu)良的特點。