長鏈非編碼RNA 漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

平貫芳,熊萬成，鄧智建

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，河南 衛(wèi)輝 453100)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)患者病死率居常見惡性腫瘤的第3位，僅次于肺癌和乳腺癌[1]。隨著環(huán)境和生活方式的改變，CRC的發(fā)病率逐漸增加[2]。目前，手術(shù)聯(lián)合放射治療和化學(xué)治療在CRC 的治療中發(fā)揮重要作用，但由于CRC易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者的5 a生存率并未得到改善[3]，腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥是 CRC治療失敗的主要原因[4]。因此，闡明其內(nèi)在機(jī)制、探索CRC治療的新靶點(diǎn)勢在必行。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，LncRNA) 漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)位于人染色體8q24.21，與多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、淋巴侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[5]。有研究顯示，PVT1表達(dá)上調(diào)在卵巢癌和乳腺癌的病理發(fā)展過程中起主要作用[6]。在胃癌組織中，PVT1的高表達(dá)可能作為一種新的診斷依據(jù)[7]。肝細(xì)胞癌組織中PVT1高表達(dá)患者一般預(yù)后不良[8]。GUO等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PVT1在CRC組織中的表達(dá)高于正常組織。PVT1上調(diào)可抑制CRC細(xì)胞的凋亡[10]。本研究通過檢測CRC組織中LncRNA PVT1 的表達(dá)量，分析其與CRC患者腫瘤 TNM分期、臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，同時通過小分子RNA干擾(small interfering RNA，siRNA) 技術(shù)特異性沉默人CRC細(xì)胞中PVT1基因，考察其對CRC細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，以期為CRC的臨床治療提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取2006年4月至2011年3月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的CRC患者的癌組織和配對癌旁組織標(biāo)本各112例，其中男 57 例，女55 例;年齡 40～70 (55.3±8.9) 歲;腫瘤分級:Ⅰ、Ⅱ級 61 例，Ⅲ、Ⅳ級51 例。所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為CRC，患者術(shù)前均未接受放射治療或化學(xué)治療。所有患者隨訪至2016年或直至死亡。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器人CRC細(xì)胞系LoVo和RKO購自美國ATCC公司；RPIM1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司，TRIzol試劑購自美國Ambion公司，細(xì)胞裂解液、LipfectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，PVT1和內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，PVT1 干擾RNA(siPVT1)及陰性對照(siRNA)序列由廣州銳博生物科技有限公司合成提供，細(xì)胞增殖試劑盒(cell counting kit 8，CCK-8)購自南京凱基生物科技股份有限公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-flourescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI) 凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Costar公司，酶標(biāo)儀、凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司，倒置相差顯微鏡購自德國蔡司光學(xué)儀器有限公司，實(shí)時熒光定量PCR 儀購自美國 ABI 公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組人CRC細(xì)胞系LoVo和RKO細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后接種于6 孔板中培養(yǎng)，待LoVo和RKO細(xì)胞融合度均達(dá)70%以上時，利用 LipfectamineTM2000脂質(zhì)體對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，每種細(xì)胞隨機(jī)分為2組：(1)siPVT1組：轉(zhuǎn)染 PVT1干擾序列 5′-CCCAACAGGAGGACAGCUUTT-3′；(2)siRNA-對照序列組：轉(zhuǎn)染陰性對照序列5′-AAGCUGUCCUCCUGUUGGG-3′。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR檢測人CRC組織及細(xì)胞中PVT1 mRNA的表達(dá)用TRIzol試劑從CRC組織和細(xì)胞中提取總RNA，總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法合成cDNA。PCR引物序列：PVT1引物正向序列為5′-CAGCACTCTGGA CGGAC-3′，反向序列為5′-CAACAGGAGAAGC AAACA-3′；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH) 引物正向序列為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向序列為5′-TCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。利用SYBRGreen核酸熒光染料通過ABI 7500 定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測。以合成的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 25 s，連續(xù)循環(huán)36次，每個樣本設(shè)3個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-ΔΔCt計(jì)算PVT1 mRNA的表達(dá)水平。GAPDH作為PVT1的內(nèi)參，以PVT1拷貝數(shù)與GAPDH拷貝數(shù)的比值為PVT1的相對表達(dá)量。根據(jù)PVT1在112例CRC樣本中相對表達(dá)量的中位值，將PVT1分為高表達(dá)組與低表達(dá)組。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 的LoVo和RKO細(xì)胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，并調(diào)整其密度為2×107L-1,接種于 96 孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè) 6 個復(fù)孔，置于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于培養(yǎng) 0、24、48、72、96 h時加入CCK-8溶液 10 μL，搖晃均勻，避光孵育，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處測定各孔吸光度。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的LoVo和RKO細(xì)胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，并調(diào)整其密度為1×109L-1，取1 mL細(xì)胞懸液置于離心管內(nèi)，4 ℃下1 000 r·min-1離心3 min，PBS沖洗后再次離心，棄上清液，于留取的細(xì)胞沉淀物中加入100 μL FITC結(jié)合緩沖液充分混合，10 μL Annexin V避光條件下孵育 15 min，再加入5 μL PI繼續(xù)避光反應(yīng) 15 min。最后再加入結(jié)合緩沖液 900 μL，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 Transwell 小室檢測CRC細(xì)胞遷移及侵襲能力取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 的LoVo和RKO細(xì)胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，分別計(jì)數(shù)各組細(xì)胞，并調(diào)整其密度為1×106L-1。取200 μL 細(xì)胞懸液直接加入小室上室，500 μL 含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的培養(yǎng)液加入下室，于37 ℃條件下培養(yǎng)；將 Matrigel 膠平鋪于 Transwell 小室上室，風(fēng)干后備用。隨后取200 μL 細(xì)胞懸液加入鋪有Matrigel膠的上室，再加入500 μL 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室，于37 ℃下培養(yǎng)48 h后取出小室，棄去多余的培養(yǎng)液，多聚甲醛對上室內(nèi)外兩側(cè)的細(xì)胞進(jìn)行固定，結(jié)晶紫染色后，用棉簽將上室內(nèi)側(cè)散落細(xì)胞輕輕除去，利用倒置顯微鏡觀察，每孔均隨機(jī)取6個高倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織和癌旁組織中PVT1 mRNA表達(dá)比較CRC組織中PVT1高表達(dá)率為 61.61% (69/112)，低表達(dá)率為 38.39% (43/112)；癌旁組織中PVT1高表達(dá)率為44.64% (50/112)，低表達(dá)率為55.36% (62/112)。CRC組織中PVT1高表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.472，P<0.01)。

2.2 PVT1 mRNA表達(dá)與CRC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系結(jié)果見表1。CRC組織中PVT1表達(dá)與患者的年齡及性別無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤直徑、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。PVT1高表達(dá)患者和低表達(dá)患者的5 a生存率分別為10.3%(6/58)、22.2%(12/54)，PVT1高表達(dá)患者5 a生存率顯著低于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 PVT1表達(dá)量與 CRC患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 Relationship between PVT1 expression and clinicopathological features of CRC patients

臨床參數(shù)nPVT1 mRNA高表達(dá)/例(%)低表達(dá)/例(%)χ2P年齡 <60歲5025(50.0)25(50.0)0.1150.734 ≥60歲6233(53.2)29(46.8)性別 男5731(54.4)26(45.6)0.3140.575 女5527(49.1)28(51.0)腫瘤直徑 ≤5 cm6326(41.3)37(58.7)6.3800.012 >5 cm4932(65.3)17(34.7)TNM分期 I、II期6123(37.7)38(62.3)10.6370.001 III、IV期5135(68.6)16(31.4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是6037(61.7)23(38.3)5.0530.025 否5221(40.4)31(59.6)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 是4430(68.2)14(31.8)7.8030.005 否6828(41.2)40(58.8)

2.3 沉默PVT1后CRC細(xì)胞系LoVo和RKO細(xì)胞中PVT1 mRNA相對表達(dá)量比較siPVT1 組和siRNA-對照序列組LoVo細(xì)胞中PVT1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.23±0.12、0.98±0.11，siPVT1組和siRNA-對照序列組RKO細(xì)胞中PVT1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.28±0.06、1.01±0.08；siPVT1組LoVo、RKO細(xì)胞中PVT1 mRNA相對表達(dá)量均顯著低于 siRNA-對照序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.05、15.64，P<0.05)。

2.4 沉默PVT1后CRC細(xì)胞系LoVo和RKO細(xì)胞增殖能力比較結(jié)果見表2。培養(yǎng)0、24 h時，siPVT1組與siRNA-對照序列組LoVo細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng) 48、72、96 h 時，siPVT1 組LoVo細(xì)胞增殖能力顯著低于siRNA-對照序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)0 h時，siPVT1 組與siRNA-對照序列組RKO細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)24、48、72、96 h時，siPVT1組RKO細(xì)胞增殖能力顯著低于siRNA-對照序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 沉默PVT1對LoVo和RKO細(xì)胞增殖能力的影響

組別細(xì)胞增殖能力0 h24 h48 h72 h96 hLoVo細(xì)胞 siRNA對照序列組0.34±0.220.95±0.222.33±0.212.80±0.263.27±0.21 siPVT1組0.32±0.150.67±0.101.50±0.16a1.85±0.22a2.35±0.15aRKO細(xì)胞 siRNA對照序列組0.31±0.161.23±0.262.26±0.152.83±0.323.36±0.15 siPVT1組0.24±0.110.65±0.22a1.22±0.16a1.93±0.15a2.36±0.11a

注：與siRNA對照序列組比較aP<0.05。

2.5 沉默PVT1后CRC細(xì)胞系LoVo和RKO細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見圖1。siPVT1 組和siRNA-對照序列組LoVo細(xì)胞的凋亡率分別為(16.47±5.41)%和(5.51±2.38)%，siPVT1 組和siRNA-對照序列組RKO細(xì)胞的凋亡率分別為(14.67±4.18)%和(6.01±1.65)%；siPVT1組LoVo、RKO細(xì)胞凋亡率均顯著高于siRNA-對照序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.180、4.313,P<0.05)。

2.6 沉默PVT1后CRC細(xì)胞系LoVo和RKO細(xì)胞遷移及侵襲能力比較結(jié)果見圖2。siPVT1 組和siRNA-對照序列組LoVo細(xì)胞遷移數(shù)分別為64.1±16.5和158.4±20.8，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為47.2±15.8和132.6±17.3；siPVT1組和siRNA-對照序列組RKO細(xì)胞遷移數(shù)分別為52.0±4.6和151.2±17.9，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為40.0±4.9和126.4±16.5；siPVT1組LoVo、RKO細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于siRNA-對照序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A：siRNA對照序列組LoVo細(xì)胞的凋亡；B：siPVT1組LoVo細(xì)胞的凋亡；C：siRNA對照序列組RKO細(xì)胞的凋亡；D：siPVT1組RKO細(xì)胞的凋亡。

圖1 沉默PVT1對CRC細(xì)胞LoVo和RKO凋亡的影響

Fig.1 Effects of PVT1 knockdown on LoVo and RKO cells apoptosis

A：siRNA對照序列組LoVo細(xì)胞的遷移；B：siPVT1組LoVo細(xì)胞的遷移；C：siRNA對照序列組RKO細(xì)胞的遷移；D：siPVT1組RKO細(xì)胞的遷移；E：siRNA對照序列組LoVo細(xì)胞的侵襲；F：siPVT1組LoVo細(xì)胞的侵襲；G：siRNA對照序列組RKO細(xì)胞的侵襲；H：siPVT1組RKO細(xì)胞的侵襲。

圖2 沉默PVT1對CRC細(xì)胞LoVo和RKO遷移和侵襲能力的影響

Fig.2 Effects of PVT1 knockdown on LoVo and RKO cells migration and invasion

3 討論

CRC是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。因此，探索其發(fā)病機(jī)制并針對特定目標(biāo)尋找新的治療策略越來越受學(xué)者的重視。有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA PVT1在乳腺癌[11]、卵巢癌、胃癌[7]、肝細(xì)胞癌[12]、前列腺癌[13]、膀胱癌、CRC等許多腫瘤中表達(dá)均上調(diào)[7，9，11-15]。PVT1的表達(dá)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有著重要意義，例如，在非小細(xì)胞肺癌組織中PVT1表達(dá)增加與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PVT1是預(yù)后的獨(dú)立因素[16]。PVT1過表達(dá)是小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良的生物學(xué)標(biāo)志物[17]。宮頸癌患者中，高表達(dá) PVT1者總體生存率較低[18]。此外，高表達(dá)PVT1的胃癌和肝癌患者往往預(yù)后不良[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，PVT1促進(jìn)了CRC的增殖，主要表現(xiàn)為：(1)PVT1 在CRC組織和細(xì)胞系中上調(diào)；(2)CRC組織中PVT1表達(dá)與腫瘤直徑、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，且PVT1低表達(dá)患者的5 a生存率較高；(3)PVT1沉默可抑制CRC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(4)PVT1沉默可抑制CRC細(xì)胞的遷移與侵襲能力?？傊?，PVT1是CRC細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)因子，以 PVT1為靶向的治療可能成為CRC的一個有效治療方案。TAKAHASHI等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PVT1的高表達(dá)與CRC預(yù)后不良有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中PVT1表達(dá)明顯升高，PVT1表達(dá)量與腫瘤大小、分級和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與CRC患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示PVT1在CRC中有著重要的臨床意義。

PVT1在腫瘤生長中起促進(jìn)作用。據(jù)報(bào)道，PVT1沉默可抑制卵巢癌和乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。PVT1在肝癌細(xì)胞中通過穩(wěn)定NOP2促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期循環(huán)和干細(xì)胞樣特性的獲取[8]。沉默PVT1可抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16-17]，降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，但可增加細(xì)胞凋亡[18]。此外，TAKAHASHI等[10]研究指出，轉(zhuǎn)染PVT1 siRNA的CRC細(xì)胞增殖和侵襲能力喪失。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中PVT1高表達(dá)率顯著高于癌旁組織，沉默LoVo、RKO細(xì)胞中PVT1可有效抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。表明沉默PVT1可抑制CRC的攻擊行為。

總之，本研究證明了PVT1是CRC發(fā)生的正性調(diào)節(jié)因子，PVT1 表達(dá)與CRC患者腫瘤直徑、TNM分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良明顯相關(guān)。沉默PVT1可抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)為以PVT1為靶向的CRC的有效治療提供了嶄新的視角。