丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)性能驗(yàn)證及評(píng)價(jià)

郭 杰，曲 沛，李韋杰，周 宇，郭晶晶，焦炳欣，王雅杰

研究認(rèn)為HCV是引起90%～95%輸血后肝炎的主要病原體[1-4]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約有2億人感染HCV，并面臨發(fā)生肝硬化和/或肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[5]。目前，血清HCV RNA定量檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室診斷丙型肝炎的金標(biāo)準(zhǔn)。及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)于HCV感染者的診斷和預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。其中HCV RNA商品試劑盒分析性能評(píng)價(jià)是保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的重要依據(jù)之一。根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)商品定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證（WS/T 420-2013）》[6]規(guī)定，當(dāng)我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法或試劑盒進(jìn)行了重要修改時(shí)，應(yīng)對(duì)廠家制定的各項(xiàng)主要分析性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，依據(jù)《美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法規(guī)88》要求，臨床實(shí)驗(yàn)室可只對(duì)下列3項(xiàng)主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證：正確度、精密度和線性（測(cè)量區(qū)間）。北京地壇醫(yī)院所采用的丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒自18012511批號(hào)開始，檢出限由250 IU/ml改為50 IU/ml，為驗(yàn)證在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下該試劑盒檢出限是否達(dá)到廠家制定的分析指標(biāo)，我們對(duì)該試劑盒的性能進(jìn)行了符合補(bǔ)充驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗(yàn)科不同濃度的臨床血清（血漿）標(biāo)本共30例，標(biāo)本濃度盡量涵蓋線性范圍，于-20℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增儀（美國(guó)，羅氏 cobas?Z480）。丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（上?？迫A，批號(hào)18012511）。HCV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）090140（北京康徹思坦生物有限公司，批號(hào)：201801001）。

1.3 性能驗(yàn)證指標(biāo)及驗(yàn)證方法 根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 420-2013）[6]、EP9-A2[7]和中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YY/T 1182-2010）[8]對(duì)上海科華丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行正確度、精密度、線性、檢測(cè)限和抗干擾能力的驗(yàn)證。

1.3.1 正確度 收集后的標(biāo)本在1周內(nèi)使用待驗(yàn)證的丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒集中檢測(cè)，并將結(jié)果與羅氏檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。檢測(cè)結(jié)果與靶值之間絕對(duì)偏R≥0.95。

1.3.2 精密度 批內(nèi)精密度：選擇濃度為1.00E+6 IU/ml和1.00E+3 IU/ml的臨床血清/血漿樣本各1例，在同一批實(shí)驗(yàn)中重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算均值（）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）值，要求CV≤5%。

批間精密度：將濃度為1.00E+6 IU/ml和1.00E+3 IU/ml 的2個(gè)標(biāo)本，在同一批試驗(yàn)中重復(fù)檢測(cè)4次，連續(xù)檢測(cè)5 d，每個(gè)水平共收集20個(gè)數(shù)據(jù)；如果出現(xiàn)失控，則應(yīng)剔除該數(shù)據(jù)并重新測(cè)定。分別統(tǒng)計(jì)2個(gè)水平標(biāo)本檢測(cè)值的和SD，再計(jì)算CV值，要求CV≤5%。

1.3.3 線性范圍 選擇臨床濃度為5.00E+7 IU/ml的血清/血漿樣本，用陰性血清按10倍梯度稀釋至2.50E+2 IU/ml，對(duì)高值陽(yáng)性標(biāo)本和稀釋后的標(biāo)本進(jìn)行同批次檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，對(duì)測(cè)定值和理論值進(jìn)行線性回歸分析，要求滿足b在0.97～1.03范圍內(nèi)，a接近于0，R2≥0.95[9-10]。

1.3.4 檢測(cè)限 取北京康徹思坦生物有限公司提供的HCV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）090140（批號(hào)201801001），用陰性血清稀釋至該試劑盒標(biāo)定的檢測(cè)限（50 IU/L）。依據(jù)YY/T1182-2010的要求，重復(fù)檢測(cè)該稀釋樣本25次，檢出22次及以上即為合格。

1.3.5 抗干擾能力 分別取高濃度（1.00E+5 IU/ml）與低濃度（1.00E+3 IU/ml）的HCV血清樣本，和含相應(yīng)的干擾物質(zhì)（膽紅素、血紅蛋白和甘油三酯）的血清分別按1∶1進(jìn)行混合，制成抗干擾樣本?；旌虾笱鍖?duì)應(yīng)所含干擾物濃度分別為：膽紅素20 mg/ml，血紅蛋白2 g/dl，甘油三酯5 g/dl。將每個(gè)混合品重復(fù)檢測(cè)3次，與之前的定值進(jìn)行比較，絕對(duì)偏差＜±0.5 lg即為合格。

2 結(jié) 果

2.1 正確度驗(yàn)證 30例含HCV RNA標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果與羅氏檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì)，檢測(cè)結(jié)果與靶值之間絕對(duì)偏差均在±0.5 lg內(nèi)，回歸方程為y=0.9881x-0.0972，R=0.998＞ 0.95。結(jié)果見表1。

表1 正確度驗(yàn)證結(jié)果Table 1 Results of accuracy verification

2.2 精密度驗(yàn)證

2.2.1 批內(nèi)精密度驗(yàn)證 采用濃度為1.00E+6 IU/ml和1.00E+3 IU/ml高、低2個(gè)水平的臨床樣本，在同一批試驗(yàn)中重復(fù)檢測(cè)20次；分別統(tǒng)計(jì)2個(gè)水平標(biāo)本檢測(cè)值的和SD，再計(jì)算CV值。高、低濃度對(duì)數(shù)值的CV分別為1.86%和2.64%，均符合CNAS-CL36規(guī)定的CV≤5%的要求。結(jié)果見表2。

表2 批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Results of intra-assay precision verification

2.2.2 批間精密度驗(yàn)證 采用濃度為1.00E+6 IU/ml和1.00E+3 IU/ml高、低2個(gè)水平的臨床樣本各1例進(jìn)行批間精密度的驗(yàn)證。分別統(tǒng)計(jì)2個(gè)水平標(biāo)本檢測(cè)值的和SD，再計(jì)算CV值。高、低濃度對(duì)數(shù)值的CV值分別為1.44%和2.36%，均符合CNAS-CL36規(guī)定的CV≤5%的要求。結(jié)果見表3。

表3 批間精密度驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Results of inter-assay precision verification

2.2.3 線性范圍驗(yàn)證 將高值陽(yáng)性標(biāo)本5.00E+7 IU/ml梯度稀釋至2.50E+2 IU/ml，實(shí)際值和理論值的回歸方程是y=1.0193x-0.1617（R=0.9996≥0.98），滿足b在0.97～1.03范圍內(nèi)，a接近于0，R2=0.9994≥0.95，線性范圍為2.50E+2～5.00E+7 IU/ml。試劑說(shuō)明書標(biāo)定的定量線性范圍為1.00E+3～1.00E+7 IU/ml，驗(yàn)證合格。結(jié)果見表4。

2.2.4 檢測(cè)限驗(yàn)證 取北京康徹思坦生物有限公司提供的HCV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用陰性血清稀釋至50 IU/ml。重復(fù)檢測(cè)該稀釋樣本30次，其中27次檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性率為90%，高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所要求的22/25，即陽(yáng)性率88%的要求，故50 IU/ml作為該試劑盒的檢出限，符合臨床要求。結(jié)果見表5。

2.2.5 抗干擾能力 分別將高濃度、低濃度的HCV RNA血清樣本和相應(yīng)干擾物質(zhì)血清按1∶1進(jìn)行混合，混合后各血清物質(zhì)所含干擾物濃度分別為膽紅素20 mg/ml，血紅蛋白2 g/dl，甘油三酯5 g/dl。將每個(gè)混合品重復(fù)檢測(cè)3次，與之前定值進(jìn)行比較，絕對(duì)偏差均＜±0.5 lg。結(jié)果見表6～7。

3 討 論

生產(chǎn)廠家推出新試劑盒前，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估。在ISO18113-2:2009[10]中明確提出生產(chǎn)廠家應(yīng)向使用者提供一系列分析性能指標(biāo)，包括：精密度、正確度、線性、特異性、最低檢出限等。當(dāng)臨床實(shí)驗(yàn)室使用已經(jīng)通過廠家嚴(yán)格評(píng)估或已經(jīng)通過SFDA批準(zhǔn)的試劑盒進(jìn)行重要修改時(shí)，須要驗(yàn)證相關(guān)分析性能，以證實(shí)在本實(shí)驗(yàn)室能達(dá)到廠家制定的分析性能指標(biāo)，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

該待驗(yàn)證HCV RNA定量檢測(cè)試劑盒自18012511批號(hào)開始檢測(cè)限由250 IU/ml改為50 IU/ml，其最低檢測(cè)下限發(fā)生了改變。因HCV RNA具有不穩(wěn)定性、易降解、易污染的特點(diǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、設(shè)備和操作人員的要求較高。本課題組在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)該試劑盒的檢出限、正確度、精密度、線性范圍逐一進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)價(jià)其性能。

在檢測(cè)限驗(yàn)證過程中，我們對(duì)濃度值為50 IU/ml的稀釋樣本重復(fù)檢測(cè)30次，有27次濃度值＞50 IU/ml，即陽(yáng)性率為90%，高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所要求的88%。50 IU/ml作為該試劑盒的檢測(cè)限，符合行業(yè)要求。但我們發(fā)現(xiàn)其余3次檢測(cè)中，有1次未檢出，另外2次檢測(cè)結(jié)果雖為陽(yáng)性，但檢出濃度均＜50 IU/ml；在實(shí)際的臨床工作中，如果實(shí)驗(yàn)室將HCV RNA的最低檢測(cè)下限定為50 IU/ml，患者樣本在該濃度時(shí)不能保證100%被檢出，易導(dǎo)致醫(yī)患糾紛，因此在制定試劑盒HCV RNA的最低檢測(cè)下限時(shí)，建議＞50 IU/ml。而在線性驗(yàn)證過程中，在2.50E+2～5.00E+7 IU/ml分析測(cè)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R=0.9996），建議該試劑盒的檢測(cè)下限定為250 IU/ml。

表4 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Results of linear range verification

表5 檢出限驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Results of detection limit verification

表6 HCV RNA高濃度血清抗干擾能力檢測(cè)結(jié)果Table 6 Results of HCV RNA high-concentration serum samples anti-interference ability

表7 HCV RNA低濃度血清抗干擾能力檢測(cè)結(jié)果Table 7 Results of HCV RNA low-concentration serum samples anti-interference ability

研究結(jié)果顯示，在正確度驗(yàn)證中，該檢測(cè)試劑與比對(duì)試劑的檢測(cè)結(jié)果高度相關(guān)，R2=0.996，R=0.998；在2.07E+3～1.05E+6 IU/ml濃度范圍具有較好的批內(nèi)精密度和批間精密度，符合CNASCL36的要求（CV均＜5%）；在抗干擾驗(yàn)證中，陽(yáng)性血清中分別加入含有干擾物質(zhì)（膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯）的血清，分別與之前的定值進(jìn)行比較，絕對(duì)偏差均＜±0.5 lg，檢測(cè)結(jié)果符合臨床需求。