桑葉生物堿對D-半乳糖誘導小鼠DNA氧化損傷的修復及作用機理

楊忠敏，沈以紅，黃先智，丁曉雯*

1(西南大學 食品科學學院，重慶市農產品加工重點實驗室，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶，400716)2(西南大學，科技處，重慶，400716)

DNA氧化損傷會使細胞發(fā)生氧化應激反應，引發(fā)基因突變、神經(jīng)性病變以及癌變等諸多不利變化[1-2]。研究表明，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)攻擊DNA脫氧核糖骨架或堿基時會導致DNA氧化損傷[3]。腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)是DNA的4種基本堿基，正常情況下，這4種堿基嚴格按照A-T、C-G配對記載生命的遺傳信息。目前已知DNA堿基受ROS攻擊可形成20種修飾堿基，如8-羥基鳥嘌呤(8-hydroxy-2′-desoxyguanosine，8-OH-dG)、5-羥基胞嘧啶(5-hydroxy-2′-deoxycotosine，5-OH-dC)等[4]。DNA被ROS攻擊發(fā)生氧化損傷時，機體可通過自身的修復機制修復損傷的DNA分子從而維持基因的穩(wěn)定狀態(tài)。研究表明，堿基切除修復(base excision repair，BER)途徑是DNA氧化損傷的重要修復途徑之一，8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(8-oxoguanine nucleoside triphos-phatase，MTH1)，8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1)、mutY同源酶(mutY homolog，MUTYH)是參與此途徑中DNA損傷修復的重要酶類[5]。

桑葉含有多種生物活性成分，如黃酮、多糖、生物堿等，具有較高的潛在藥用價值，是一種具有豐富來源的營養(yǎng)保健食品資源[6]。桑葉生物堿是以1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，1-DNJ)為主的多羥基哌啶類生物堿，具有降糖[7]、抗病毒[8]、抑制腫瘤轉移[9]等作用。王興婷等[10]研究體外表明桑葉生物堿對DPPH自由基、羥基自由基具有較好的清除作用，分別為IC50=0.589 g/L、IC50=1.788 g/L。彭曉蝶[11]研究表明,桑葉生物堿粗提液能上調機體抗氧化酶的mRNA表達，提高機體抗氧化酶活力，使小鼠MDA含量下降，從而證實桑葉生物堿具有調控脂質過氧化的作用。TANG等[12]也證實，1-DNJ能提高羅非魚體內的抗氧化酶活力來改善其脂質氧化。筆者前期研究已證明，桑葉生物堿在體外模擬胃腸消化體系中具有較好DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力[13]，同時也進一步證實了其能通過增強小鼠機體抗氧化能力來改善小鼠脂質、DNA及蛋白質氧化損傷[14]。但目前針對桑葉生物堿修復DNA氧化損傷的研究特別是有關機理的研究尚未見報道。因此，本文采用D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)誘導小鼠建立氧化損傷模型，然后給實驗小鼠灌胃不同劑量的桑葉生物堿，通過測定BER途徑相關酶活力的變化及其mRNA表達，在前期研究的基礎上深入探討桑葉生物堿在體內對DNA氧化損傷的修復作用及機理，為開發(fā)桑葉生物堿改善機體氧化應激狀況的相關保健食品提供理論依據(jù)，為防御機體DNA氧化損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明種小鼠60只(SPF級)，4周齡，平均質量為20 g左右，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號SCXK(渝)2018-0003)提供；基礎飼料，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。桑葉粉末，購于重慶市蠶業(yè)科學技術研究院。桑葉生物堿，實驗室自制[13]，總生物堿含量為93.57%(質量分數(shù))。

D-Gal (純度≥99%)、GSH (純度≥98%)：阿拉丁有限公司；8-OH-dG、5-OH-dC、MTH1、OGG1、MUTYH酶聯(lián)吸附免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定試劑盒：廈門慧嘉生物科技有限公司；DNA ladder抽提試劑盒：碧云天生物科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒：北京百泰克生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(Til RNaseH Plus)試劑盒：寶生物工程(大連)有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Symergy H1酶標儀，基因有限公司；811DK高速冷凍離心機，Eppendorf AG；KQ5200DB超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；T100T型PCR、CFX96 Real-time PCR、NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計、GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)，美國Thermo公司；DW-HL438型超低溫冰箱合肥美菱股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型建立

60只雄性SPF級昆明種小鼠，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分出10只小鼠為正常對照組，其余小鼠連續(xù)腹腔注射D-Gal(1 000 mg/(kg·BW))20 d，構造氧化應激模型。以造模組、正常對照組小鼠血清中MDA、SOD水平是否存在顯著性差異為判定指標。正常對照組注射等量的生理鹽水。

造模成功后，正常對照組小鼠灌胃生理鹽水，將造模成功小鼠隨機分為模型對照組(灌胃生理鹽水)、陽性藥物組(灌胃200 mg/(kg·BW) GSH)、桑葉生物堿低、中、高劑量組(分別灌胃50、100、200 mg/(kg·BW)桑葉生物堿)，每組各10只。實驗期間，小鼠每天稱體質量1次，并根據(jù)體質量變化按照0.1 mL/10 g每天灌胃1次，連續(xù)灌胃8周。

小鼠按照西南大學實驗動物保護和使用規(guī)則飼養(yǎng)，實驗期間室內通風條件良好，控制動物房溫度為(23±2)℃、相對濕度40%～60%，12 h明暗交替(9:00 am～21:00 pm)，所有小鼠均喂飼普通飼料，自由覓食、飲水。

1.3.2 樣本采集

8周實驗結束后，各實驗組小鼠禁食不禁水12 h，摘取小鼠眼球取血于肝素鈉采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，上清液即為血漿，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩２裳戤吅?，頸椎脫臼處死小鼠，快速取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血漿8-OH-dG、5-OH-dC的含量及MTH1、OGG1、MUTYH的酶活力測定

均按照試劑盒提供的方法進行操作。

1.3.4 肝組織DNA損傷水平檢測

按照DNA ladder試劑盒進行檢測。

1.3.5 肝組織MTH1、OGG1、MUTYH mRNA表達的測定

按照RNA提取試劑盒的方法提取肝臟組織總RNA。再根據(jù)反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉為cDNA，再進行PCR擴增。取上述反轉錄產物1 μL作為反應模板，進行Real-time PCR反應，反應體系10 μL。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，如表1所示。Real-time PCR反應條件：95 ℃，4 min預變性；95 ℃，15 s變性，60 ℃，30 s退火，共39個循環(huán)。以β-actin作內參基因，分別測定肝組織MTH1、OGG1、MUTYH的相對表達量，結果以2-△△Cq表示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 桑葉生物堿對小鼠血漿8-OH-dG、5-OH-dC水平的影響

研究表明，8-OH-dG是ROS攻擊DNA分子中鳥嘌呤堿基中第8位C原子而形成的一種氧化性加合物，可作為內源性或外源性因素造成DNA氧化損傷的標志物[15]。DNA氧化損傷產物種類較多，僅測定一種不能完全評估DNA氧化損傷程度，而5-OH-dG被證實是另一類重要的DNA氧化損傷產物[4]。本研究測定各組小鼠血漿中8-OH-dG、5-OH-dC水平，以考察桑葉生物堿對DNA氧化損傷的影響，結果如表2所示。

表2 桑葉生物堿對小鼠血漿中8-OH-dG、5-OH-dC的影響Table 2 Effects of mulberry leaf alkaloids on 8-OH-dG and 5-OH-dC in plasma

注：*表示與正常組對照比較存在顯著性差異(P<0.05)，**表示極顯著性差異(P<0.01)；#表示與模型組比較存在顯著性差異(P<0.05)，##表示極顯著性差異(P<0.01)。下同。

由表2可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠8-OH-dG、5-OH-dC含量分別增加了204.10%、177.36%(P<0.01)，表明模型組小鼠發(fā)生了DNA氧化損傷。與模型組對照組相比，陽性藥物使小鼠8-OH-dG、5-OH-dC水平分別減少了66.03%、64.06%(P<0.01)；桑葉生物堿中、高劑量組均下調了小鼠8-OH-dG、5-OH-dC水平，其中高劑量組下調最多，分別下調65.35%、59.13%(P<0.01)。上述結果表明，桑葉生物堿能明顯修復小鼠的DNA氧化損傷，且有明顯的量-效關系，高劑量能使8-OH-dG、5-OH-dC恢復至與正常組無顯著性差異的水平(P>0.05)。

2.2 桑葉生物堿對小鼠血漿中BER途徑相關酶活力的影響

BER途徑是生物體針對氧化損傷、烷基化等因素導致堿基變異的主要修復機制[16]。BER起識別和切除修飾堿基(如8-OH-dG)的作用，主要從DNA特異性糖基化酶起始，包括MTH1、OGG1和MUTYH[17]。本研究測定各組小鼠血漿中MTH1、OGG1、MUTYH活力的變化，以考察桑葉生物堿對DNA損傷BER途徑的影響，結果如表3所示。

由表3可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠MTH1、OGG1、MUTYH的活力分別下降了28.29%、58.18%、56.66%(P<0.01)，表明模型小鼠修復DNA氧化損傷的能力大大下降。與模型組對照組相比，陽性藥物使小鼠MTH1、OGG1、MUTYH活力分別增加了38.70%、135.16%、117.74%(P<0.01)；桑葉生物堿中、高劑量組均能增加小鼠血漿中MTH1、OGG1、MUTYH活力，其中高劑量組分別使它們增加了37.09%、134.44%、114.29%(P<0.01)。結果表明，桑葉生物堿明顯增加小鼠DNA氧化損傷相關修復酶的酶活水平，且有明顯的量-效關系，高劑量能使小鼠MTH1、OGG1、MUTYH恢復至與正常組無顯著性差異水平(P>0.05)。

表3 桑葉生物堿對小鼠血漿MTH1、OGG1、MUTYH的影響Table 3 Effects of mulberry leaf alkaloids on MTH1,OGG1 and MUTYH in plasma

2.3 DNA ladder檢測桑葉生物堿對小鼠肝臟DNA損傷的作用

細胞凋亡后，細胞染色體的DNA會發(fā)生降解，在瓊脂糖凝膠電泳上會呈現(xiàn)特異性的梯狀ladder圖譜，而壞死的呈彌漫的聯(lián)續(xù)圖譜[18]。采用DNA ladder方法檢測桑葉生物堿對小鼠肝臟DNA損傷的作用，結果如圖1所示。

M-DNA ladder marker； 1-正常對照組;2-模型對照組；3-陽性對照組；4、5、6-桑葉生物堿低、中、高劑量組圖1 桑葉生物堿對小鼠肝臟的DNA ladder結果Fig.1 Effects of mulberry leaf alkaloids on DNAladder in mouse liver

由圖1可知，模型組小鼠DNA經(jīng)染色成像后呈現(xiàn)類似于梯子上的踩踏板，表明模型組小鼠出現(xiàn)了DNA的衰亡及損傷。桑葉生物堿低劑量組呈現(xiàn)與模型組類似的情況，表明低劑量桑葉生物堿對DNA氧化損傷無改善作用；陽性對照組、桑葉生物堿中、高劑量組泳道上僅出現(xiàn)單一DNA條帶，分子質量最大，且亮度與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)，表明陽性藥物組、桑葉生物堿中、高劑量組對小鼠肝臟細胞氧化損傷有明顯修復作用，與血漿指標的測定結果一致。

2.4 桑葉生物堿對小鼠肝臟組織BER途徑修復酶mRNA表達的影響

MTH1、OGG1和MUTYH是BER途徑的重要修復酶，且主要表達靶器官是肝臟組織[19-20]。如果DNA發(fā)生氧化損傷，則MTH1、OGG1和MUTYH的mRNA表達將會減少。本研究考察桑葉生物堿是否是從轉錄水平調節(jié)DNA氧化損傷修復酶的活力水平。結果如圖2～圖4所示。

2.4.1 桑葉生物堿對小鼠肝臟組織MTH1的mRNA表達的影響

由圖2可知，與正常對照組相比，模型組小鼠MTH1 mRNA表達水平降低了68.11%(P<0.01)。與模型對照組相比，陽性藥物組、桑葉生物堿高劑量組使小鼠MTH1 mRNA表達水平分別增加了198.02%、192.35%(P<0.01)，與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。結果表明，一定劑量的桑葉生物堿能增加DNA中BER途徑中MTH1修復酶mRNA水平，且高劑量組使MTH1的mRNA表達恢復到正常水平。說明桑葉生物堿是通過調控MTH1的mRNA表達水平進而使MTH1酶活水平升高而進行DNA氧化損傷修復的。

圖2 桑葉生物堿對小鼠肝臟MTH1 mRNA表達的影響Fig.2 Effect of mulberry leaf alkaloids on MTH1mRNA expression in mouse liver

2.4.2 桑葉生物堿對小鼠肝臟組織OGG1 mRNA表達的影響

由圖3可知，與正常對照組相比，模型組小鼠OGG1 mRNA表達水平降低了58.07%(P< 0.01)。與模型對照組相比，陽性藥物組、桑葉生物堿高劑量組使小鼠OGG1 mRNA表達水平分別增加了115.86%、103.96%(P<0.01)，與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。結果表明，桑葉生物堿能增加DNA BER途徑中OGG1修復酶mRNA水平，且高劑量組OGG1 mRNA表達恢復至與正常對照組無顯著性差異的水平(P>0.05)，說明桑葉生物堿是通過調控OGG1的mRNA表達水平進而使OGG1酶活水平升高而進行DNA氧化損傷修復的。

圖3 桑葉生物堿對小鼠肝臟OGG1 mRNA表達的影響Fig.3 Effect of mulberry leaf alkaloids on OGG1 mRNAexpression in mouse liver

2.4.3 桑葉生物堿對小鼠肝臟組織MUTYH mRNA表達的影響

由圖4可知，與正常對照組相比，模型組小鼠MUTYH mRNA表達水平降低了60.21%(P<0.01)。與模型對照組相比，陽性藥物組、桑葉生物堿高劑量組使小鼠MUTYH mRNA表達水平分別增加了112.57%、109.36%(P<0.01)，與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 桑葉生物堿對小鼠肝臟MUTYH mRNA表達的影響Fig.4 Effect of mulberry leaf alkaloids on MUTYHmRNA expression in mouse liver

結果表明，桑葉生物堿能增加DNA BER途徑中MUTYH修復酶mRNA水平，且高劑量組MUTYH mRNA表達恢復與正常對照組無顯著性差異的水平(P>0.05)。說明桑葉生物堿通過調控MUTYH的mRNA表達水平進而使MUTYH酶活水平升高而進行DNA氧化損傷修復的。

3 討論與結論

近年來，桑葉因其營養(yǎng)價值和藥理作用而引起研究者的廣泛關注。生物堿類化合物是桑葉的重要活性成分之一，具有較好降糖、降脂等功能[21-22]，但其在對DNA氧化損傷的作用及機理鮮有報道。

實驗動物注射外源性D-Gal后，機體會產生大量ROS，造成生物大分子(蛋白質、脂質、DNA)的氧化損傷，是目前公認的造氧化應激模型的方法[23]。本研究以DNA氧化損傷小鼠為考察對象，探討不同劑量桑葉生物堿對DNA氧化損傷的改善作用及作用機理。當DNA的堿基受到ROS的攻擊時，由于鳥嘌呤的分子軌道具有較高的能級，其第8位碳原子極易被氧化損傷而生成修飾堿基8-OH-dG，進而發(fā)生G∶C→T∶A顛換突變[24]。FEIG等[25]采用氧基試劑處理脫氧胞嘧啶三磷酸苷，并用陰離子交換高效液相色譜柱分離其反應產物后，通過人體免疫缺乏反轉錄酶插入含有靶位基因的DNA中，測定其產生的突變，證實了DNA另一種重要氧化損傷產物5-OH-dC。同時也有研究發(fā)現(xiàn)5-OH-dC誘導C→T轉換的突變率要大于其他氧化損傷產物[26-27]。ULLAH等[28]研究表明，咖啡堿能降低機體8-OH-dG水平，改善DNA氧化損傷。本研究也發(fā)現(xiàn)，氧化應激小鼠血漿中8-OH-dG、5-OH-dG極顯著高于正常小鼠，經(jīng)灌胃不同劑量桑葉生物堿后，隨著生物堿劑量的增加，8-OH-dG、5-OH-dG呈現(xiàn)降低趨勢，且有明顯的量效關系，200 mg/(kg·BW)的桑葉生物將它們恢復至正常水平(P>0.05)，而且結果與DNA ladder的結果一致，說明桑葉生物堿對DNA氧化損害具有較好的修復作用。

DNA是生命體重要的遺傳物質，其完整性對維持機體健康具有重要意義。機體DNA損傷增加會導致基因變異、基因功能障礙及基因組不穩(wěn)定，進而引發(fā)疾病，如腫瘤、多神經(jīng)退行性疾病等[29-30]。生物體自身存在多種對DNA損傷的修復系統(tǒng)，包括錯配修復、核苷酸切除修復、BER途徑、同源重組等[31]。BER途徑是生物體針對氧化損傷、烷基化等因素導致堿基變異的主要修復機制，涉及多個步驟、多種酶參與。BER途徑中的MTH1基因，主要負責在DNA復制前水解核苷酸池中氧化的dGTP、GTP、dATP和ATP產物，如8-OHdGTP，從而防止其作為原料進入DNA鏈的復制過程，有效防止A∶T→G∶C的顛換[32]。OGG1基因，同時具有AP裂解酶和糖苷酶的活性，具有特異切除8-OH-dG的功能，它能啟動BER修復系統(tǒng)[33]。MAMBO等[34]研究發(fā)現(xiàn)，OGG1 mRNA低表達與DNA氧化損傷修復減弱有關。MUTYH基因，只具有糖苷酶的活性，主要負責切除DNA復制后與8-OH-dG錯配的A，進而阻止G∶C→T∶A的顛換[35]。本研究表明，一定劑量的桑葉生物堿可促進MTH1、OGG1、MUTYH mRNA表達，同時能使DNA氧化損傷小鼠機體MTH1、OGG1、MUTYH的酶活力恢復至正常水平，進而改善小鼠DNA的氧化損傷水平。

綜上所述，一定劑量的桑葉生物堿能顯著改善D-Gal誘導小鼠DNA氧化損傷，具有較好的抗氧化作用，其作用機制可能是從轉錄水平調控BER途徑中相關酶的活力從而修復DNA氧化損傷。該研究結果為桑葉生物堿抗氧化相關保健功能食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。