微池頂空萃取GC-MS法分析香茅草揮發(fā)性風(fēng)味成分

施志凡，尹金芳，左怡丹，熊華斌，楊志，高云濤*,戴建輝*

(云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，昆明 650500)

香茅草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]別名檸檬草，禾本科草本植物，在我國主要分布于華南、西南等地[1]。因其具有獨(dú)特的芳香風(fēng)味，具有疏風(fēng)通絡(luò)、和胃通氣、安神醒腦等藥理功效，廣泛應(yīng)用于食品調(diào)料中[2]。香茅草含有多種揮發(fā)性風(fēng)味成分，且含量較高[3]，因此對(duì)其揮發(fā)性成分的研究受到關(guān)注[4]。李國明等[5]采用水蒸氣蒸餾法分離、GC-MS分析，從瑞麗檸檬香茅草中鑒定出桂花醛、檸檬醛、香茅醇等43種揮發(fā)性成分；喻世濤等[6]同樣采用水蒸氣蒸餾法獲得不同香茅草中的揮發(fā)性成分，經(jīng)GC-MS鑒定出檸檬烯、香茅醛、香茅醇、香葉酯等34種揮發(fā)性成分。

頂空微萃取技術(shù)包括頂空固相微萃取、單滴頂空微萃取，因其具有自動(dòng)便捷、快速高效、功能多樣等優(yōu)點(diǎn)[7-9]，在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析中獲得廣泛應(yīng)用[10-12]。固相微萃取操作方便、無需溶劑、靈敏度高，但其成本較高，多次使用后可能出現(xiàn)萃取頭交叉污染等問題[13-15]；單滴頂空微萃取雖成本低、裝置簡單、有機(jī)溶劑用量少，但亦存在萃取劑懸掛穩(wěn)定性差和有機(jī)溶劑揮發(fā)損失過快的問題，導(dǎo)致無法使用乙酸乙酯、石油醚等揮發(fā)性有機(jī)溶劑。近年來，離子液體具有較低的蒸汽壓、揮發(fā)損失小[16-18]，在單滴頂空微萃取中的應(yīng)用受到關(guān)注，但因其密度大、易脫落，且不能等其他有機(jī)溶劑反萃取后才能進(jìn)行分析檢測(cè)將其應(yīng)用于單滴頂空微萃取[19,20]。

本文制作了一種新型的微池頂空微萃取裝置，使用揮發(fā)性乙酸乙酯作為萃取劑，實(shí)現(xiàn)了香茅草揮發(fā)性成分的頂空微萃取，結(jié)合GC-MS對(duì)香茅草主要風(fēng)味成分進(jìn)行了分析[21]。本文提及的裝置克服了溶劑懸掛穩(wěn)定性差的問題，萃取劑用量大幅增加，更重要的是，該裝置可使用萃取性能優(yōu)良的乙酸乙酯等揮發(fā)性溶劑為頂空萃取劑，且簡單易操作、快速分析、萃取效率高，作為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的快速分析方法，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

香茅草樣品采于云南省德宏州芒市中山鄉(xiāng)，經(jīng)教育部-國家民委民族藥資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊青松副教授鑒定為禾木科香茅屬檸檬草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]，采集的香茅草樣品將莖葉部分清洗，風(fēng)干，切成小段放入粉碎機(jī)中研磨至60目以下，置于密封袋內(nèi)冷藏保存。

1.1.2 試劑

正己烷(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、石油醚(色譜純)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體[C4MIM][BF4](上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 儀器

KO733B730000080氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司；微量進(jìn)樣器(50.0，10.0 μL) 上海安亭科學(xué)儀器廠；20 mL鉗口頂空瓶。

1.2.2 微池頂空萃取裝置

本文采用微池萃取裝置代替進(jìn)樣針單滴微萃取裝置，見圖1。

圖1 微池頂空萃取裝置結(jié)構(gòu)(a)及微池剖面(b)

該裝置包括吸盤、掛柱、微池三部分，均為四氟乙烯材料，微池內(nèi)最多可容納200.0 μL萃取劑，掛柱一端與微池通過卡口連接，另一端與吸盤連接，吸盤與頂空瓶墊片吸合，從而使微池探入頂空瓶內(nèi)。使用時(shí)將樣品置于頂空瓶底部，將帶有微池的頂空瓶蓋與頂空瓶口密閉鉗合，用微量進(jìn)樣器吸取適量萃取劑，針頭刺破頂空瓶墊并將萃取劑注入微池中，在一定溫度下頂空萃取一定時(shí)間，用進(jìn)樣器吸出微池中的剩余萃取劑進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 方法

1.3.1 單滴頂空微萃取

用10.0 μL微量進(jìn)樣器移取一定體積的萃取劑，進(jìn)樣器針頭刺入頂空瓶內(nèi)，針尖到達(dá)頂空瓶1/3位置處，推送萃取液形成液珠懸掛于微量進(jìn)樣器針尖，在一定溫度下，懸掛一定時(shí)間，將萃取劑吸回微量進(jìn)樣器內(nèi)讀取其剩余體積，進(jìn)行后續(xù)分析，離子液體萃取劑用正己烷反萃取后[22]，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.2 微池頂空萃取

稱取1.5 g香茅草樣品加入頂空瓶中，根據(jù)1.2.2中圖1的微池頂空萃取裝置，用微量進(jìn)樣器移取一定體積萃取劑，進(jìn)樣器針頭刺入頂空瓶內(nèi)，將萃取劑注入微池內(nèi)，在一定溫度下萃取一定時(shí)間，用進(jìn)樣器吸出微池中的剩余萃取劑，讀取其剩余體積，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.3 GC-MS分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX(30 m×0.25 m×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度220 ℃；柱初溫45 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升到90 ℃，保持2 min；再以6 ℃/min升到200 ℃，保持5 min；高純氦氣(純度>99.999%)；載氣流速1.0 mL/min；分流比10∶1；進(jìn)樣量1.0 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源(EI)；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度260 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 微池頂空萃取條件下4種萃取劑的穩(wěn)定性

圖2 不同萃取時(shí)間下萃取劑的剩余量

本文選擇正己烷、乙酸乙酯、石油醚、離子液體([C4MIM][BF4])4種頂空萃取劑測(cè)試其在進(jìn)樣針針尖上的懸掛量，最大懸掛量為：離子液體(4.9 μL)>石油醚(4.7 μL)>正己烷(4.4 μL)>乙酸乙酯(4.0 μL)，均不超過5.0 μL，這說明上述溶劑由于重力、表面張力、沸點(diǎn)、蒸汽壓、粘度等性質(zhì)影響，其在進(jìn)樣針針尖的懸掛穩(wěn)定性通常較差，可懸掛溶劑量較少。進(jìn)一步考察正己烷、乙酸乙酯、石油醚、[C4MIM][BF4]離子液體4種萃取劑在單滴頂空微萃取過程中的揮發(fā)穩(wěn)定性，由圖2a可知，室溫(20 ℃)條件下，當(dāng)萃取劑初始體積為4.0 μL時(shí)，4種萃取劑的回收量隨萃取時(shí)間的變化，除[C4MIM][BF4]離子液體具有較好的揮發(fā)穩(wěn)定性外，石油醚、乙酸乙酯和正已烷的回收量迅速減小，4 min之內(nèi)，幾乎揮發(fā)殆盡，這表明由于進(jìn)樣針針尖所能懸掛的萃取劑量很小，除低揮發(fā)的離子液體等溶劑之外，正己烷、乙酸乙酯、石油醚等萃取性能優(yōu)良的有機(jī)溶劑并不適用于單滴頂空微萃取過程。

針對(duì)單滴頂空微萃取裝置存在的萃取劑穩(wěn)定性問題，本文設(shè)計(jì)的微池頂空萃取裝置(見圖1)將萃取劑置于微池中而不是懸掛于進(jìn)樣針針尖，相對(duì)單滴頂空微萃取法，微池頂空萃取萃取劑初始用量可達(dá)到200 μL，增加數(shù)十倍，由圖2b可知，當(dāng)萃取劑初始用量50.0 μL時(shí)，室溫(20 ℃)條件下頂空萃取3種揮發(fā)性萃取劑的回收量依次為：石油醚(6.0 μL)<正己烷(12.0 μL)<乙酸乙酯(27.0 μL)，明顯優(yōu)于單滴頂空微萃取裝置。

在萃取劑初始用量50.0 μL和萃取時(shí)間20 min條件下，微池頂空萃取溫度對(duì)萃取劑回收量的影響見圖3。

圖3 微池頂空萃取溫度對(duì)萃取劑回收量的影響

注：萃取時(shí)間為20 min；萃取劑初始體積為50.0 μL。

隨著萃取溫度增加，除[C4MIM][BF4]離子液體回收量幾乎不變之外，其他3種揮發(fā)溶劑回收量迅速減小，當(dāng)萃取溫度達(dá)50 ℃時(shí)，石油醚、正己烷和乙酸乙酯的剩余量分別為5，16，23 μL，當(dāng)萃取溫度達(dá)60 ℃時(shí)，經(jīng)過20 min的較長時(shí)間萃取，石油醚幾乎完全揮發(fā)，而正己烷和乙酸乙酯仍然分別有10.0 μL和3.0 μL的剩余量，能較好地滿足氣相色譜法或GC-MS法對(duì)進(jìn)樣樣品用量的要求。

2.2 4種萃取劑的微池頂空萃取性能

萃取劑初始用量為50 μL，萃取時(shí)間為20 min和萃取溫度為45 ℃條件下，研究了正己烷、乙酸乙酯、石油醚和[C4MIM][BF4]離子液體4種萃取劑對(duì)香茅草揮發(fā)性風(fēng)味的物質(zhì)萃取性能，4種萃取劑微池頂空萃取物的GC-MS測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖4 香茅草正己烷(a)、乙酸乙酯(b)、石油醚(c)和[C4MIM][BF4]離子液體(d)微池頂空萃取物的GC圖

由圖4可知，正己烷(22個(gè)峰)、乙酸乙酯(25個(gè)峰)、石油醚(21個(gè)峰)均比[C4MIM][BF4]離子液體(16個(gè)峰)獲得更多的色譜峰，具有更好的萃取效果。

4種萃取劑中檸檬烯、香茅醛、香茅醇、香葉醇、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯和欖香烯7種香茅草特征風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定色譜峰面積值見圖5。

圖5 室溫(20℃)下不同萃取劑中7種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的色譜峰面積

注：溫度為20 ℃，萃取時(shí)間為10 min，萃取劑體積為50.0 μL。

由圖5可知，乙酸乙酯對(duì)7種特征風(fēng)味物質(zhì)具有較高的色譜峰面積，其次是石油醚和正己烷，[C4MIM][BF4]離子液體萃取性能最差，甚至不能檢測(cè)出香茅醇和香葉醇兩種重要風(fēng)味物質(zhì)，進(jìn)一步說明乙酸乙酯對(duì)香茅草特征風(fēng)味物質(zhì)具有較好的萃取性能，因此，本文選擇乙酸乙酯作為頂空萃取劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本文基于微池頂空萃取裝置建立的微池頂空萃取法，萃取劑初始用量可達(dá)50.0 μL甚至更高，較單滴頂空微萃取法萃取劑用量5 μL增加10倍以上，即使揮發(fā)性較強(qiáng)的萃取劑，在經(jīng)過較長時(shí)間頂空萃取后，仍然有足夠萃取劑剩余量供后續(xù)的GC或GC-MS等分析，相對(duì)于離子液體單滴頂空微萃取方法，微池頂空萃取法可選擇性能更為優(yōu)良的揮發(fā)性頂空萃取劑，獲得更好的萃取效果，該且方法檢出靈敏度較單滴頂空微萃取方法有較明顯提高。

2.3 微池頂空條件優(yōu)化

2.3.1 萃取溫度的影響

在萃取劑用量50.0 μL，萃取20.0 min條件下，研究萃取溫度對(duì)乙酸乙酯頂空萃取7種典型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)效率的影響，結(jié)果見圖6。

隨著溫度升高，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)色譜峰面積隨之增加，萃取溫度達(dá)到45 ℃時(shí)色譜峰面積達(dá)到最大，萃取溫度超過45 ℃后，色譜峰面積隨著溫度升高反而下降?？赡苁悄繕?biāo)物質(zhì)在萃取劑和氣相中的分配服從亨利定律，溫度增加，目標(biāo)物質(zhì)的分壓也隨之增加，導(dǎo)致其在溶劑中的溶解能力下降。其次，溫度過高也易導(dǎo)致頂空瓶內(nèi)出現(xiàn)掛水珠的情況，部分目標(biāo)物進(jìn)入水珠中，從而影響萃取平衡。因此，本文確定其最佳萃取溫度為45 ℃。

圖6 萃取溫度對(duì)萃取效率的影響

注：萃取劑體積為50 μL，萃取時(shí)間為20 min。

2.3.2 萃取時(shí)間和萃取劑用量的影響

進(jìn)一步研究萃取時(shí)間對(duì)萃取性能的影響，見圖7。

圖7 萃取時(shí)間對(duì)萃取效率影響

隨著萃取時(shí)間增加，各物質(zhì)色譜峰面積也隨之增加，萃取時(shí)間達(dá)到15.0 min時(shí)各萃取峰面積接近最大，至20.0 min時(shí)趨于平緩，20.0 min后幾乎不變，本文確定的最佳萃取時(shí)間為20 min。

在萃取劑體積分別為20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，70.0 μL時(shí)，研究萃取劑體積對(duì)萃取性能的影響，見圖8。

圖8 萃取劑體積對(duì)萃取效率的影響

各目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰面積隨著萃取劑體積的增加而增加，當(dāng)用量達(dá)到40.0 μL時(shí)色譜峰面積達(dá)最大，但萃取劑用量超過50.0 μL，色譜峰面積反而減少，可能是萃取劑用量過大的稀釋作用所致，且萃取劑體積過多達(dá)到反應(yīng)平衡所需時(shí)間也隨之增長，因此，本文確定的萃取劑體積為40.0 μL。

2.4 香茅草揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)微池頂空萃取GC-MS分析結(jié)果

本文采用微池頂空萃取法用乙酸乙酯作為萃取劑，初始體積為40.0 μL，樣品用量為1 g，在溫度為45 ℃下平衡15 min，通過GC-MS分析香茅草揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及相對(duì)含量，并與[C4MIM][BF4]離子液體初始體積4.0 μL，單滴頂空微萃取進(jìn)行比較，其結(jié)果見表1。

表1 不同萃取法萃取香茅草中揮發(fā)性成分及峰面積

由表1可知，乙酸乙酯微池頂空萃取共鑒定出25種香茅草揮發(fā)性風(fēng)味成分，而單滴頂空微萃取僅萃取出13種，這表明本文提出的乙酸乙酯微池頂空萃取較單滴頂空微萃取具有更高的萃取效率。本研究獲得的香茅草主要揮發(fā)性成分相對(duì)含量最高的成分是香茅醛(20.35%)，其次依次為香茅醇(18.59%)、檸檬烯(16.60%)、香葉醇(14.13%)、欖香醇(7.34%)、α-欖香烯(4.33%)、乙酸香葉酯(2.78%)、乙酸香茅酯(2.73%)、桉葉油醇(1.99%)、γ-蓽澄茄烯(1.43%)、杜松醇(1.38%)、異胡薄荷醇(1.30%)、石竹烯(1.25%)、癸醛(1.00%)、2,6-二甲基-5-庚烯醛(0.99%)、芳樟醇(0.78%)、D-大根香葉烯(0.67%)、肉豆蔻酸(0.49%)、金合歡醇(0.51%)、甲基庚烯酮(0.34%)、α-依蘭油烯(0.29%)、甲酸香葉酯(0.23%)、4-甲基-1-(1-甲基乙基)-雙環(huán)[3,1,0]己二烯(0.23%)、角鯊烯(0.16%)、癸酸(0.14%)等。由結(jié)果可知，香茅草中的成分大多為醇類、酯類和烯類物質(zhì)。香茅醛具有香茅、檸檬香氣；香葉醇具有溫和的玫瑰花香味；欖香醇帶有愉悅的花香，略帶辛辣的茴香氣味；香茅醇具有甜玫瑰香。這些物質(zhì)構(gòu)成了香茅草的清香風(fēng)味。經(jīng)與已有文獻(xiàn)對(duì)比，本法檢出香茅草中揮發(fā)性風(fēng)味成分種類與CO2超臨界萃取法、水蒸氣蒸餾法、固相萃取法接近，再次證明了本法的可行性價(jià)值。此外，本法具有操作簡單、設(shè)備成本低廉、萃取效率高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并制作了一種新型微池頂空萃取裝置，可明顯增加頂空萃取劑用量，有效解決了揮發(fā)性有機(jī)萃取劑在頂空過程中揮發(fā)穩(wěn)定性差的問題，將揮發(fā)性有機(jī)溶劑乙酸乙酯用于香茅草揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的頂空萃取，建立了香茅草揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的乙酸乙酯微池頂空萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，相對(duì)于單滴頂空微萃取，可檢出更多的揮發(fā)性物質(zhì)，主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢出靈敏度明顯增加。相對(duì)于已有的超臨界CO2萃取法、頂空固相微萃取法、水蒸氣蒸餾法，本文提出的微池頂空萃取法在保證萃取效率的同時(shí)，具有簡單快速、分析成本低廉等明顯優(yōu)點(diǎn)，適合于對(duì)食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行快速、高效的分析。