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    內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的影響

    2019-11-13 03:39王婷婷胡萍張順利
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年17期
    關(guān)鍵詞:免疫耐受內(nèi)毒素

    王婷婷 胡萍 張順利

    摘要:研究了內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量和分布的影響,以探討巨噬細(xì)胞對胚胎的著床和維持的作用。采用昆明系妊娠小鼠分為對照組和試驗(yàn)組,在小鼠妊娠6 d(D6)對照組腹腔注射生理鹽水,試驗(yàn)組分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組,分別注射1、2、4 μg劑量的內(nèi)毒素,用酶組織化學(xué)染色的方法顯示出子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量和分布。結(jié)果顯示,與對照組相比較,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增多,差異極顯著,而試驗(yàn)Ⅱ組與對照組沒有顯著差異。巨噬細(xì)胞在子宮環(huán)肌外層、環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜上的分布與對照組相比較,環(huán)肌外層巨噬細(xì)胞數(shù)量減少,而環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多,差異顯著。提示內(nèi)毒素使妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞向子宮內(nèi)膜遷移,而不利于胚胎著床和維持,可能對母胎免疫耐受產(chǎn)生影響。

    關(guān)鍵詞:內(nèi)毒素;妊娠小鼠;酶組織化學(xué);巨噬細(xì)胞;免疫耐受

    中圖分類號:S852.2 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號:1002-1302(2019)17-0193-03

    妊娠是一個(gè)復(fù)雜的生理過程,從免疫學(xué)上來看類似于器官移植。胚胎對母體來說是一個(gè)移植物,母體免疫系統(tǒng)對此進(jìn)行識(shí)別,并產(chǎn)生免疫應(yīng)答[1]。巨噬細(xì)胞是子宮內(nèi)的一種重要免疫細(xì)胞,有多種表面標(biāo)志和標(biāo)記酶,具有抗感染、抗腫瘤、呈遞抗原和免疫調(diào)節(jié)等作用。巨噬細(xì)胞的數(shù)量和在子宮內(nèi)的分布在胚胎的著床和維持中起到一定的作用[2-3]。

    內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復(fù)合物,可刺激機(jī)體對多糖成分產(chǎn)生抗體[4]。內(nèi)毒素作為外源性致熱原(熱原質(zhì)),作用于中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。內(nèi)毒素能夠激活妊娠小鼠子宮內(nèi)的巨噬細(xì)胞,從而對胚胎的著床和維持產(chǎn)生影響[5],也對母胎免疫耐受產(chǎn)生一定的影響。

    本試驗(yàn)通過給妊娠期小鼠注射不同劑量的內(nèi)毒素,通過酶組織化學(xué)染色方法,研究內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的影響,探討巨噬細(xì)胞在胚胎的著床和維持中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[6] 成年雌性昆明種小鼠40只,由河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供,體質(zhì)量(25±2) g,自由飲水取食。分成對照組與試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組,雌、雄鼠按2 ∶ 1合籠,次日晨查見陰栓者為妊娠1 d,到妊娠6 d(D6)時(shí),對照組腹腔注射生理鹽水,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別注射 1、2、4 μg劑量的內(nèi)毒素,8 d(D8)觀察流產(chǎn)情況并取材。

    1.1.2 主要化學(xué)藥品和試劑 內(nèi)毒素,購自Sigma公司;α-醋酸萘酯(α-NAE),購自上海試劑一廠;固藍(lán)B鹽購自德國Chroma-gesellschaft公司;其他試劑均為分析純。

    1.1.3 主要儀器 冰凍切片機(jī)(美國Reichert Histo Stat Microtome Cryostat),柯達(dá)DC 290數(shù)碼相機(jī)。

    1.2 方法

    1.2.1 小鼠子宮材料的獲取 小鼠脫頸椎處死,沿腹中線剪開腹腔,取其子宮,在預(yù)冷的生理鹽水中快速去除脂肪,迅速放入液氮中冷凍30 s。標(biāo)記好材料放入-20 ℃冰箱中保存。

    1.2.2 冰凍切片的制備 -20 ℃下冰水包埋材料,修塊,切片,切片的厚度8 μm,材料平鋪在載玻片上,涼干后-20 ℃冰箱冷凍保藏。

    1.2.3 0.2 mol/L PBS鹽溶液配制 A液:NaH2PO4·2H2O 3.12 g加100 mL蒸餾水;B液:Na2HPO4·12H2O 7.16 g加100 mL蒸餾水;取A液13 mL加B液87 mL,混合均勻,調(diào)pH值至7.4。

    1.2.4 孵育液配制 0.03 g α-醋酸萘酯+5 mL丙酮充分溶解+5 mL蒸餾水混勻+20 mL PBS鹽溶液(要邊加邊搖晃防止生成沉淀)+固藍(lán)B鹽。充分?jǐn)嚢枞芙饣靹?。注意孵育液要即配即用?/p>

    1.2.5 酶組織化學(xué)染色 (1)把冰凍切片室溫下充分干燥。(2)放入純丙酮液中固定10 min。(3)取出固定好的切片用0.2 mol/L的PBS鹽溶液沖洗3次,每次5 min。(4)把沖洗好的切片放入配制好的孵育液中,37 ℃溫浴鍋孵育50 min。(5)從孵育液中取出切片,用0.2 mol/L PBS鹽溶液沖洗1次,5 min。放入0.2 mol/L PBS鹽溶液中浸泡5 min,再放入蒸餾水中浸泡2 min,取出后甘油明膠封片。(6)鏡檢、拍照、統(tǒng)計(jì)分析。

    1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用χ2檢驗(yàn),α=0.05,結(jié)果大于α差異不顯著,小于α差異顯著。2 結(jié)果與分析

    2.1 酶組織化學(xué)染色巨噬細(xì)胞的結(jié)果

    鏡檢觀察子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞多為不規(guī)則形狀,也有呈橢圓形、圓形的,染色結(jié)果細(xì)胞質(zhì)呈紫色,而細(xì)胞核為無色(圖1)。

    2.2 內(nèi)毒素對妊娠小鼠胚胎著床的影響

    正常小鼠的胚胎為粉紅色,透明度較高。注射內(nèi)毒素后能誘使胚胎流產(chǎn),先出現(xiàn)陰道出血,然后出現(xiàn)胚胎吸收。對照組未觀察到流產(chǎn),胚胎為粉紅色;試驗(yàn)Ⅰ組小鼠未見流產(chǎn),但發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)有黑紅色的瘀血;試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組流產(chǎn)率分別為75%和100%,胚胎已經(jīng)模糊不清,出現(xiàn)吸收現(xiàn)象(表1)。

    2.3 內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響

    注射不同劑量的內(nèi)毒素使妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的總數(shù)呈波動(dòng)性變化,注射1 μg內(nèi)毒素巨噬細(xì)胞數(shù)量較正常對照組明顯增加,2 μg時(shí)數(shù)量又下降到正常水平,4 μg時(shí)數(shù)量又增加(圖2)。

    妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的總體數(shù)量變化,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著,而試驗(yàn)Ⅱ組與對照組相比差異不顯著(表2)。

    2.4 內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞分布的影響

    妊娠小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞數(shù)量分布的變化,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著,而試驗(yàn)Ⅱ組與對照組相比差異不顯著(表3)。

    妊娠小鼠子宮內(nèi)環(huán)肌層巨噬細(xì)胞的數(shù)量分布變化,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著,而試驗(yàn)Ⅱ組與對照組相比差異顯著(表4)。

    妊娠小鼠子宮內(nèi)環(huán)肌外層巨噬細(xì)胞的數(shù)量分布變化,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著,而試驗(yàn)Ⅱ組與對照組相比差異顯著(表5)。

    注射不同劑量的內(nèi)毒素使妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量分布發(fā)生變化。隨著注射內(nèi)毒素劑量的逐漸增加,環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜的細(xì)胞數(shù)量增加, 環(huán)肌外層細(xì)胞數(shù)量減少。正常情況下,巨噬細(xì)胞大多數(shù)分布于子宮外膜,注射內(nèi)毒素刺激環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加。雖然試驗(yàn)Ⅱ組妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞總數(shù)量沒有變化,但巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)的分布與對照組相比環(huán)肌內(nèi)層的數(shù)量明顯增多(圖3)。

    3 討論

    文獻(xiàn)報(bào)道非特異性酯酶α-NAE存在于單核細(xì)胞、粒細(xì)胞系統(tǒng)中,而子宮內(nèi)的其他細(xì)胞幾乎不含此物質(zhì)[7],本研究觀察子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞多為不規(guī)則形狀,也有呈橢圓形、梭形。α-NAE主要存在于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),染色結(jié)果細(xì)胞質(zhì)呈紫色,而細(xì)胞核為無色。用此方法可以很簡便很快速地顯示陽性巨噬細(xì)胞,與組化染色相比很經(jīng)濟(jì),但也有一定的缺點(diǎn),比如染色很容易褪色、不易長時(shí)間保存。

    有文獻(xiàn)報(bào)道在妊娠期D8肌層中幾乎沒有巨噬細(xì)胞[8],本研究也觀察到相同的結(jié)果,所以在對巨噬細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)時(shí)把子宮結(jié)構(gòu)分為環(huán)肌外層、環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    研究發(fā)現(xiàn),1 μg內(nèi)毒素能使小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,使小鼠子宮內(nèi)膜、肌層的巨噬細(xì)胞都與對照有顯著性差異,但是隨著內(nèi)毒素劑量的增加,到2 μg時(shí),子宮總的巨噬細(xì)胞基本沒有變化,但是肌層巨噬細(xì)胞和對照相比有了顯著性差異。4 μg 時(shí),全部的孕鼠均發(fā)生了流產(chǎn),但總的子宮巨噬細(xì)胞數(shù)量和1 μg沒有顯著性差異。但是同樣,流產(chǎn)小鼠子宮內(nèi)膜和肌層的巨噬細(xì)胞都與對照有顯著性差異。由此,推測子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量的多少和LPS的用量有關(guān)。在一定的LPS范圍內(nèi),巨噬細(xì)胞的數(shù)量隨LPS劑量增加而減少到一定水平,但是當(dāng)LPS量繼續(xù)增大時(shí),巨噬細(xì)胞的數(shù)量將會(huì)增多。

    小鼠在正常妊娠期間子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量分布隨時(shí)間不斷地發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,在小鼠妊娠D8子宮內(nèi)的巨噬細(xì)胞主要集中在子宮的環(huán)肌外層,而環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜中幾乎沒有巨噬細(xì)胞,有利于胚胎著床和維持。妊娠期子宮內(nèi)巨噬細(xì)胞過多存在對于妊娠不利[9]。本研究也觀察到了這種現(xiàn)象,但是試驗(yàn)還觀察到了2 μg劑量巨噬細(xì)胞總數(shù)基本沒有變化,但是在子宮內(nèi)部的分布卻發(fā)生了變化,也就是說巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)發(fā)生了遷移,從而導(dǎo)致流產(chǎn)。

    但內(nèi)毒素是如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的遷移呢?試驗(yàn)組與對照組相比巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增加,而且巨噬細(xì)胞在子宮環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜的分布數(shù)量也明顯增加,試驗(yàn)Ⅱ組雖然巨噬細(xì)胞數(shù)量又降到正常的水平,但巨噬細(xì)胞分布在環(huán)肌內(nèi)層的數(shù)量也明顯增加。

    內(nèi)毒素并不干擾孕鼠的正常內(nèi)分泌功能,也不能穿越胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)。內(nèi)毒素誘導(dǎo)流產(chǎn)的一個(gè)重要機(jī)制是引起預(yù)致敏的(primed)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α[10-12]。TNF-α導(dǎo)致流產(chǎn)已被動(dòng)物試驗(yàn)所證實(shí),內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)與子宮內(nèi)TNF-α的產(chǎn)生有直接關(guān)系,本試驗(yàn)中內(nèi)毒素能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由子宮外膜向子宮內(nèi)膜發(fā)生遷移,使子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,推測遷移到內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α。它可直接引起胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡,因滋養(yǎng)層前祖細(xì)胞在未成熟階段發(fā)生程序性死亡而耗竭,導(dǎo)致子宮內(nèi)胎兒缺乏營養(yǎng)而死亡[13]。使妊娠小鼠子宮內(nèi)的胚胎不能正常著床和維持,可能不利于母胎免疫耐受,使母鼠對胚胎產(chǎn)生排斥而流產(chǎn),所以內(nèi)毒素能激活巨噬細(xì)胞,使巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向子宮內(nèi)發(fā)生遷移,影響胚胎的著床和維持,導(dǎo)致妊娠小鼠流產(chǎn)。

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