乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜解毒酶活性的影響

劉暢 王芳 陳曉婷

摘要：乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜具有觸殺作用，但其作用機制尚未明確。采用有機溶劑超聲提取乳漿大戟毒素，并利用生物化學(xué)方法測定枸杞棉蚜取食后體內(nèi)相關(guān)解毒酶的活性變化。結(jié)果表明，隨乳漿大戟毒素濃度升高，羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性降低，表明乳漿大戟毒素對這2種解毒酶具有抑制作用;堿性磷酸酶活性和P450酶含量顯著升高，說明乳漿大戟毒素對這2種解毒酶具有誘導(dǎo)作用。乳漿大戟毒素可顯著影響昆蟲的代謝酶，且其對羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的抑制作用可能與其毒殺作用有關(guān)。為闡明乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜致死的作用機制，開發(fā)以乳漿大戟為基礎(chǔ)的枸杞蚜蟲可持續(xù)控制新技術(shù)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：乳漿大戟;毒素提取;枸杞棉蚜;體內(nèi)解毒酶;活性變化;綠色防控

中圖分類號： S482.3+9;S435.671 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0125-03

蚜蟲是危害枸杞的重要害蟲[1-2]，廣泛分布于我國枸杞種植區(qū)[3]。其中，枸杞蚜蟲在寧夏回族自治區(qū)地區(qū)1年發(fā)生15代，繁殖系數(shù)高，世代重疊嚴重，對枸杞子的產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大[4]。蚜蟲聚集于枸杞新梢或莖部，吸食汁液，影響枸杞正常開花結(jié)果。目前，枸杞蚜蟲的防治仍以化學(xué)防治為主，但是長期大量不合理使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致枸杞蚜蟲抗藥性日趨嚴重，加大了枸杞蚜蟲的猖獗危害[5]。同時，化學(xué)農(nóng)藥帶來的農(nóng)藥殘留超標、減少天敵數(shù)量及環(huán)境污染等一系列問題也日益突出。這些不利因素促使人們迫切尋求環(huán)境友好的植物保護方式。近年來，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中植物源農(nóng)藥主要來自于植物中具有活性的天然物質(zhì)，比如噻吩類及多炔類化合物等[6]，這些殺蟲劑的開發(fā)源于其新穎的靶標及專一性強、安全性高、不易產(chǎn)生抗藥性等特點[7-8]。因此研究具有殺蟲活性的天然化合物致毒機制，探索新作用靶標，是農(nóng)藥開發(fā)研究范疇的重點和前沿。

乳漿大戟（Euphorbia esula Linn.）為大戟科，多年生草本植物，常見于干旱山坡、草地或路邊，在寧夏主要分布于六盤山、羅山、賀蘭山及固原市等草地，資源豐富。乳漿大戟根系發(fā)達，生命力極強，不僅占據(jù)草場面積，消耗草地的水分和養(yǎng)分，競爭取代其他有經(jīng)濟價值的優(yōu)良牧草，使草場的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，而且植物本身有毒[9]，大面積草場因乳漿大戟的蔓延被牲畜忌避而荒廢，給草地畜牧業(yè)生產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟損失[10]。乳漿大戟含有的白色或黃白色乳汁，對皮膚有刺激性和毒性，但可以抗腫瘤、抗菌和抗白血病等，具有重要的藥用價值[11]。2013年王芳等發(fā)現(xiàn)其對枸杞蚜蟲具有一定的殺蟲活性[12]，隨后研制了乳漿大戟制劑，并明確了其作用方式，但對枸杞蚜蟲的致死機制并不明確[13]。為更好地建立以乳漿大戟為基礎(chǔ)的枸杞蚜蟲綠色防控新技術(shù)，明確其對枸杞蚜蟲的致死作用機制尤為重要。通過測定乳漿大戟提取物對枸杞蚜蟲體內(nèi)解毒酶活性的變化，從毒理學(xué)揭示乳漿大戟對枸杞蚜蟲致死的作用機制，為進一步深入了解其致死作用機制及建立枸杞蚜蟲綠色防控新技術(shù)提供技術(shù)支撐，為化學(xué)農(nóng)藥的減施、枸杞害蟲的可持續(xù)治理及枸杞安全生產(chǎn)提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲源 枸杞棉蚜（Aphis gossypii Glover）采自園林場枸杞園，均為個體大小一致、健康的無翅成蚜。采集時間為2017年8月。

1.1.2 供試試劑 毒扁豆堿購自Sigma公司;α-乙酸萘酯、固藍B鹽、十二烷基硫酸鈉（SDS）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）等均為國產(chǎn)生化試劑;谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒、酸性磷酸酶（ACP）測試盒、堿性磷酸酶（AKP）測試盒、昆蟲（Insect）細胞色素P450（CYP450）ELISA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲羧酸酯酶活性影響 將乳漿大戟干粉樣品用乙醇超聲波提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得乳漿大戟毒素。參照Asperen的方法[14]，將枸杞棉蚜（每個處理500頭以上）用乳漿大戟毒素25、50、100、200 mg/mL不同濃度藥液處理，12 h后挑選活蟲200頭，加0.04 mol/L，pH值7.0的磷酸緩沖液5 mL，冰浴勻漿，勻漿液于轉(zhuǎn)速10 000 r/min下，4 ℃離心15 min，把上清液作為酶源。以α-乙酸萘酯（3×10-4 mol/L，含10-4 mol/L毒扁豆堿）為底物，經(jīng)酯酶水解后生成α-萘酚與顯色劑（5%十二烷基硫酸鈉水溶液中含1%堅牢藍B）作用變?yōu)樯钏{色，測定波長600 nm處的吸光度，重復(fù)3次，以酶量（mL）為自變量，吸光度為因變量，繪制標準曲線，計算1 mL酶液生成的α-萘酚量，酶液再經(jīng)考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量（μg/頭），代入標準曲線中算出羧酸酯酶的比活力[μmol/（mg·15 min）]。

1.2.2 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶影響 乳漿大戟毒素提取方法見“1.2.1”節(jié)，酶源處理參照“121”節(jié)。采用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒測定谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性。其原理為

谷胱甘肽+1-氯-2，4-二硝基苯GST谷胱甘肽二硝基苯復(fù)合 物+ 鹽酸;

GSH+C6H3（NO2）2ClGSTC6H3（NO2）2GS+HCl。

還原型谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶催化下與1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB底物）反應(yīng)，在反應(yīng)時間內(nèi)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性與反應(yīng)前后底物濃度呈正方向線性關(guān)系。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性越強，谷胱甘肽含量減少越多。

1.2.3 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲磷酸酶活性影響 乳漿大戟毒素提取方法見“1.2.1”節(jié)，酶源處理參照“1.2.1”節(jié)。采用南京建成生物工程研究所的酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）測定試劑盒測定磷酸酶活性。其原理為磷酸苯二鈉在酸性和堿性磷酸酶催化作用下產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚與4-氨基安替吡啉在堿性溶液中經(jīng)鐵氰化鉀氧化變成紅色，根據(jù)顏色深淺程度測定酶活性大小。

1.2.4 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲細胞色素P450酶含量影響 乳漿大戟毒素提取方法見“1.2.1”節(jié)，酶源處理參照“121”節(jié)。采用細胞色素P450試劑盒測定昆蟲細胞色素P450酶含量。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗。往酶標板的微孔中，依次加入標本、標準品、辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育洗滌。3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在過氧化物酶的催化下變藍色，并在酸的作用下變成黃色。顏色的深淺程度和樣品的細胞色素P450酶活性呈正相關(guān)關(guān)系。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣品P450酶含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜羧酸酯酶活性的影響

由圖1可見，乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲羧酸酯酶活性有一定的抑制作用，當乳漿大戟濃度為50 mg/mL時，抑制作用達到20%，當乳漿大戟毒素濃度達到 200 mg/mL 時，抑制作用達到40%。

2.2 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響

由圖2可見，乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲谷胱甘肽 S- 轉(zhuǎn)移酶活性有顯著的抑制作用（P<0.05），隨著毒素濃度增加，抑制作用增強，與對照相比，當乳漿大戟毒素濃度達到200 mg/mL時，抑制作用達到90%。

2.3 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性影響

用微板法測定乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲ACP和AKP活性的影響，結(jié)果見圖3。乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲ACP活性沒有顯著性影響。AKP具有誘導(dǎo)作用，當乳漿大戟毒素濃度增加時，AKP活性升高，當乳漿大戟毒素濃度達到50 mg/mL時，與對照相比AKP活性顯著升高（P<0.05）。

2.4 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲細胞色素P450酶含量影響

采用雙抗體-步夾心法酶聯(lián)免疫吸附法測定乳漿大戟毒素對細胞色素P450酶含量的影響，結(jié)果見圖4。乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲細胞色素P450酶含量有顯著的誘導(dǎo)作用。隨著濃度增加，P450酶含量顯著升高，當乳漿大戟毒素濃度達到200 mg/mL時，P450酶含量變化與乳漿大戟毒素濃度 100 mg/mL 時相比不顯著。

3 結(jié)論與討論

一直以來， 科研人員致力于開發(fā)具有生物活性的植物源農(nóng)藥，對植物源農(nóng)藥的應(yīng)用，采用簡單方法就是用粗提物進行加工利用，以達到防治害蟲的目的。乳漿大戟作為植物源農(nóng)藥原材料來防治枸杞棉蚜，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α９P者實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，乳漿大戟對枸杞棉蚜具有顯著的毒殺作用，并且以觸殺作用為主。枸杞棉蚜在取食有毒有害植物時，體內(nèi)的酶也會發(fā)生變化，接觸植物毒性嚴重影響棉蚜體內(nèi)的酶活性變化。棉蚜對有毒物質(zhì)刺激反應(yīng)的劇烈程度可能與化合物的毒性大小有關(guān)。本研究從解毒代謝方面揭示了乳漿大戟對枸杞棉蚜的致死作用機制。隨著乳漿大戟毒素濃度升高，羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性降低，說明乳漿大戟毒素對這2種解毒酶具有抑制作用;堿性磷酸酶活性和P450酶含量顯著升高，說明乳漿大戟毒素對這2種解毒酶具有誘導(dǎo)作用。

羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、酸性/堿性磷酸酶和細胞色素P450酶系[15]是昆蟲體內(nèi)重要的解毒代謝酶，參與水解、還原、氧化、軛合等代謝過程[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，枸杞棉蚜取食后，成蟲體內(nèi)羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性受到顯著抑制，導(dǎo)致其乳漿大戟有毒物質(zhì)的解毒代謝能力下降，引起昆蟲死亡。羧酸酯酶可以與進入昆蟲體內(nèi)的有毒物質(zhì)迅速結(jié)合，將有毒物質(zhì)在到達靶標作用位點前阻隔或降解。當枸杞棉蚜取食乳漿大戟毒素后，羧酸酯酶活性降低，降解毒素能力下降，因此毒素迅速到達靶標作用位點而發(fā)揮作用。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲對農(nóng)藥或者有毒物質(zhì)代謝中重要的共軛酶系之一，它能使外源的親電基團與體內(nèi)的還原型谷胱甘肽發(fā)生共軛代謝，而保護體內(nèi)其他親核的中心[19-20]，乳漿大戟毒素對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的抑制，可能會使谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對內(nèi)源或外源毒素的降解能力下降。乳漿大戟毒素處理枸杞棉蚜后堿性磷酸酯酶和細胞色素P450酶被誘導(dǎo)激活，可能是昆蟲的一種應(yīng)激性反應(yīng)，即增強昆蟲對毒素解毒代謝，以起到解毒作用[21]。這種激活作用與昆蟲對植物的抗性有關(guān)，可能是由于乳漿大戟毒素影響了昆蟲體內(nèi)的水解代謝，或外源物乳漿大戟毒素刺激枸杞棉蚜增強了水解代謝，提高了昆蟲本身的耐藥性。如果開發(fā)為植物源藥劑，可通過與代謝酶抑制劑進行復(fù)配來提高乳漿大戟毒素的藥效。

綜上所述，乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的抑制與其毒殺作用有關(guān)，隨著毒素濃度升高，其毒殺作用增強，昆蟲的解毒代謝能力變?nèi)?，最終死亡。羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲體內(nèi)重要的解毒代謝酶，其可能是乳漿大戟的作用靶標之一，由于乳漿大戟的致毒機制復(fù)雜多樣，至今作用靶標還不明確，因此有必要對其進一步從微觀層面深入研究，將有望開發(fā)出作用機制獨特的植物源農(nóng)藥。

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