豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)研究進(jìn)展

孫偉　劉杉杉　周佳　黃雪飛　吳強(qiáng)

摘要：豬傳染性胃腸炎在全世界范圍內(nèi)暴發(fā)，臨床癥狀主要以仔豬腹瀉、嘔吐和脫水為主，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，給生豬養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著混合感染加劇，特別是與TGE類似病癥的傳染病的出現(xiàn)，單純依靠臨床觀察和病理變化，很難對(duì)該病做出準(zhǔn)確診斷，因此需要借助于免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。本文就免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在TGE診斷中的最新應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，以期為TGE的防控提供一定的科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎;免疫學(xué);分子生物學(xué);診斷技術(shù);研究進(jìn)展

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染引起的一種高度接觸性烈性傳染病。TGEV與豬群高發(fā)病率密切相關(guān)，臨床癥狀主要以腹瀉、嘔吐和脫水為主。不同年齡和品種的豬群均易感，其中2周齡以內(nèi)仔豬感染TGEV后，可出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，病死率高達(dá)100%[1]。1933年美國(guó)首次出現(xiàn)TGE，并在1946年由Doyle和Hutchingd首次分離并鑒定第一株TGEV[2]。隨后，TGE相繼出現(xiàn)在日本、英國(guó)等歐洲、北美洲和亞洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。我國(guó)自上世紀(jì)60年代首次發(fā)病以來(lái)，TGE不斷在我國(guó)大部分地區(qū)流行，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。TGEV給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文就TGE的診斷技術(shù)和研究現(xiàn)狀做如下綜述，以期為TGE的有效預(yù)防和研究提供科學(xué)參考。

1病原特征

TGEV是一種有囊膜的、單股正鏈RNA病毒，分類學(xué)上屬于冠狀病毒科a冠狀病毒屬成員。病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑約為100_150nm[3]。TGEV基因組全長(zhǎng)28.6kb，共編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。

TGEV對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)，20℃存放2周或是35℃存放24h，仍具有感染性。糞尿和腸道組織中的病毒粒子，在低溫下保存數(shù)月，滴度仍無(wú)明顯改變。但TGEV對(duì)光和紫外線敏感，經(jīng)照射后很快失活。乙醚、氯仿、甲醛、去氧膽酸鈉等有機(jī)溶劑作用后很快失活。

2診斷技術(shù)研究

TGE是一種高度接觸性傳染病，易和豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PED）、豬A群輪狀病毒（porcine A group rotavirus，PGAR）混合感染，且三者臨床癥狀、傳播途徑類似，很難區(qū)分。因此，快速診斷對(duì)于TGE的有效防控具有十分重要的意義。然而，目前很難對(duì)TGE做出臨床確診，仍需要借助于分子生物學(xué)或是免疫學(xué)方法，才能做出最終的鑒別診斷。

2.1免疫學(xué)診斷技術(shù)

2.1.1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)方法敏感性高、特異性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)對(duì)大量樣本進(jìn)行病原和血清抗體檢測(cè)。宋振輝等[5]通過(guò)原核系統(tǒng)表達(dá)的TGEV衣殼蛋白為抗原，建立了一種檢測(cè)TGE的間接ELISA方法，相比于商品化的抗體檢測(cè)試劑盒，特異性、敏感性和符合率分別達(dá)到了93.8%、93.5%和93.5%。屈月等[6]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，建立了由TGEVN蛋白單克隆抗體和多克隆抗體構(gòu)成的夾心ELISA方法。結(jié)果表明，該方法具有良好的重復(fù)性，與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)。同樣，原核表達(dá)TGEVS基因主要的抗原位點(diǎn)序列，并通過(guò)該重組蛋白建立的間接ELISA方法與TGEV包被的ELISA方法相比較，檢測(cè)結(jié)果符合率也高達(dá)90%以上。尹杰等[7]基于編碼S基因的B、C抗原位點(diǎn)，建立的間接ELISA方法特異性和重復(fù)性均較好，且敏感性遠(yuǎn)高于血清中和試驗(yàn)，有望應(yīng)用于TGEV的檢疫和進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。郭宏偉等[8]對(duì)N蛋白進(jìn)行了表達(dá)，建立了可檢測(cè)TGEV血清抗體的間接ELISA方法，通過(guò)與中和試驗(yàn)比較，符合率為100%，且檢測(cè)假陽(yáng)性和假陰性率低。

2.1.2病毒中和試驗(yàn)

S蛋白突出于TGEV病毒粒子表面，是唯一能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白。然而研究發(fā)現(xiàn)，TGEV與豬呼吸道冠狀病毒（porcine respiratory coronavirus，PRCV）序列存在高度的相似度，利用中和試驗(yàn)檢測(cè)TGEV抗體時(shí)兩者之間存在交叉反應(yīng)，降低了診斷的特異性，因此限制了中和試驗(yàn)在TGE診斷的應(yīng)用。

2.1.3膠體金技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、診斷結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒和寄生蟲等動(dòng)物性疾病診斷。常亮等[9]利用檸檬酸納還原法制備的膠體金試紙條，可特異性檢測(cè)出低至150μg/mL的TGEV，該試紙條可在常溫下保存1年之久，有望用于生產(chǎn)實(shí)際。李嘉琛[10]等研發(fā)了一種可標(biāo)記TGEV單抗的膠體金顆粒，將其包被在玻璃纖維膜上，并分別以羊抗鼠lgG和TGEV單抗為質(zhì)控線和檢測(cè)線。結(jié)果顯示，該試紙條檢測(cè)靈敏度為102TCID50/O.1mL，且與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果和進(jìn)口試紙卡吻合。

2.2分子生物學(xué)診斷技術(shù)

2.2.1RT-PCR技術(shù)

PCR技術(shù)自出現(xiàn)以來(lái)，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。RT-PCR是指以mRNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)。早在1997年，Pa-ton等[11]建立了一種基于S基因序列，檢測(cè)TGEV的RT-PCR方法，可用于與PRCV鑒別診斷。通過(guò)對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RT-PCR敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的病毒分離和ELISA檢測(cè)手段。Dong等[12]坷針對(duì)N基因保守區(qū)建立了RT-PCR檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)臨床樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，特異性和重復(fù)性100倍優(yōu)于普通PCR。王黎等[13]針對(duì)N基因保守序列建立的RT-PCR方法，完成了幾百份臨床樣品的檢測(cè)，靈敏度高達(dá)1Opg。

2.2.2巢式RT-PCR （RT-nPCR）技術(shù)

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過(guò)采用兩對(duì)特異性引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，大大提高了反應(yīng)的敏感性和特異性。20世紀(jì)80年代以來(lái)，出現(xiàn)了一種新的名為PRCV的TGEV變異毒株。與TGEV相比較，僅在S基因的5端672位和681位之間出現(xiàn)了缺失。美國(guó)學(xué)者Kim[14]基于S基因缺失片段，首次建立了可用于PEDV和PRCV鑒別診斷的RT-nPCR技術(shù)，可直接對(duì)糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)。隨后，Jung等[15]建立了一種新的雙重RT-nPCR技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)出組織病理切片中PEDV和TGEV，與原位雜交技術(shù)相比較，吻合率為100%。Salem等”[16]進(jìn)一步建立了多重RT-nPCR，可同時(shí)檢測(cè)出發(fā)生腹瀉的樣品中PEDV、TGEV和PRV感染情況。該方法可檢測(cè)到的TGEV下限濃度為102TCID50/mL。Rodrl guez等[17]通過(guò)對(duì)TGEV高度保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了可用于檢測(cè)組織培養(yǎng)和臨床樣品中TGEV含量的RT-nPCR，有助于對(duì)豬場(chǎng)TGEV做出診斷。

2.2.3雙重或是多重RT-PCR

雙重或多重RT-PCR可通過(guò)在檢測(cè)體系中加入1對(duì)以上的特異性引物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種以上病原微生物檢測(cè)的目的，該方法在混合感染樣品檢測(cè)中顯得尤為重要。TGEV常和PEDV、PGAR混合感染，且臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)極為相似，因此需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)才可以做出確診。

早在2007年，Kim等[14]就建立了同時(shí)可以檢測(cè)和定量PEDV和TGEV的多重RT-PCR法。人為感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，腹瀉剛一出現(xiàn)便可采用該方法檢測(cè)到PEDV和TGEV。張坤等[15]根據(jù)PEDVM基因、TGEVN基因、PGARVP7基因建立的多重PCR可檢測(cè)到最低35pg限量的三聯(lián)疫苗混合RNA。通過(guò)對(duì)75份豬糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，與常規(guī)RT-PCR相比較，該技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感度高，可用于檢測(cè)腹瀉樣品中的PEDV、TGEV和PGAR。我國(guó)學(xué)者陳芳等[19]為了對(duì)TGE和PED混合感染做出準(zhǔn)確的鑒別診斷，建立了同時(shí)可檢測(cè)這兩種病原體的雙重PCR方法，結(jié)果表明可檢測(cè)出lOpg TGEV RNA和lOOpg PEDV RNA。閆若潛等[20]也建立了特異性較好的PEDV和TGEV二重PCR檢測(cè)方法，可檢測(cè)到lOTCID50/mL的病毒含量。

2.2.4熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)

qRT-PCR技術(shù)具有靈敏度高、可實(shí)時(shí)定量的特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測(cè)，對(duì)于疾病的高通量檢測(cè)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。2007年，Bai等[21]建立的基于TaqMan探針的qRT-PCR方法，可檢測(cè)15.3拷貝/μL的質(zhì)粒DNA，遠(yuǎn)高于普通PCRl.53x103拷貝/μL的檢測(cè)極限，且具有良好的重復(fù)性和特異性。Vemula-palli等[22]通過(guò)對(duì)TGEV的S基因進(jìn)行序列比對(duì)，設(shè)計(jì)出特異性引物并引入綠色熒光蛋白作為內(nèi)參，建立的TaqMan熒光定量RT-PCR技術(shù)，可用于糞便樣品檢測(cè)，靈敏度可達(dá)2.8個(gè)拷貝，且能與其他種豬呼吸道病毒冠狀病毒鑒別診斷。龔雙燕等[23]建立的SYBR Green Ⅱ qRT-PCR檢測(cè)方法可用于提高初乳中TGEV檢出率。通過(guò)對(duì)130份腹瀉母豬的初乳進(jìn)行檢測(cè)，qRT-PCR可檢測(cè)出10份陽(yáng)性樣品，而普通PCR僅檢測(cè)5份，說(shuō)明建立的熒光定量PCR檢測(cè)敏感性高，更加適用于病毒微量的樣品檢測(cè)，提高了檢出率。侯月娥等[24]建立的雙重TaqMan熒光定量一步法qRT-PCR，可同時(shí)檢測(cè)PEDV和TGEV，靈敏度均可達(dá)101個(gè)拷貝，可快速完成對(duì)臨床樣品的檢測(cè)。

2.2.5反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Media ted lsothermal Amplifi-cation，LAMP）是一種新的核酸擴(kuò)增方法，其可在等溫條件下擴(kuò)增出DNA/RNA，并具有較高的特異性和靈敏性，且無(wú)需特殊的設(shè)備，已經(jīng)廣泛用于口蹄疫病毒、流感病毒以及豬水皰病毒等多種RNA病毒的檢測(cè)。Chen等[25]針對(duì)TGEV保守的N基因，設(shè)計(jì)出6對(duì)特異性引物，可檢測(cè)到1Opg病毒RNA，靈敏度遠(yuǎn)高于普通PCR。Li等[26]采用3對(duì)N基因的特異性引物，通過(guò)優(yōu)化條件后，60℃孵育30min便可以較高靈敏度檢測(cè)出TGEV，并能與其他病毒進(jìn)行鑒別診斷。該方法簡(jiǎn)便易行，適用于TGEV現(xiàn)場(chǎng)診斷。

3小結(jié)與展望

TGE在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)TGE高效、特異性診斷顯得尤為重要。目前，對(duì)于TGE尚需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，才能減少診斷的誤差，提高診斷的準(zhǔn)確性。其中，分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有高效、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室中得到了廣泛的應(yīng)用。RT-nPCR和多重PCR的出現(xiàn)，提高了檢測(cè)的效率和特異性，特別是qRT-PCR技術(shù)的應(yīng)用大大提高了檢測(cè)的特異性和靈敏性。但是，受到儀器設(shè)備條件的限制，尚無(wú)法應(yīng)用到臨床現(xiàn)場(chǎng)診斷。

隨著科技的進(jìn)步，多種便捷式的檢測(cè)手段問(wèn)世，有望對(duì)豬病現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行TGE診斷。近幾年，膠體金診斷試紙條的出現(xiàn)對(duì)于提高臨床檢測(cè)提供了巨大的方便，特別適用于廣大基層獸醫(yī)工作者，這也是今后科學(xué)研發(fā)的一個(gè)重要方向。目前豬病復(fù)雜多樣，且多為混合感染，這給疾病的鑒別診斷帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。因此需要綜合運(yùn)用多種檢測(cè)方法，揚(yáng)長(zhǎng)避短，才能提高檢測(cè)的靈敏性和特異性，更好服務(wù)于我國(guó)乃至世界的養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang X，Shj H Y，Chen J F，ef al.Identification of cellular pro-teome using two-dimensional difference gel elctrophoresis in STcells infected with transmissible gastroenteritis coronavirus [J].Pro—teome Science，2013，11（1）：31-31.

[2]黃海龍，胡桂學(xué)，陶淑霞.豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉診斷方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（3）：43-46.

[3] Tajima M.Morphology of transmissible gastroenteritis virus of pigS[J].Archiv Fu r Die Gesamte Virusforschung，1970，29（1）：105-108.

[4]滿坤，于萍萍，湯波，等.豬傳染性胃腸炎病毒強(qiáng)毒株的分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017，（11）：205-207.

[5]宋振輝，郭萬(wàn)柱，張鸚俊.豬傳染性胃腸炎病毒核衣殼蛋白的表達(dá)及在ELISA中的初步應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，17（2）：201-205.

[6]屈月，葛俊偉，唐麗杰，等.豬傳染性胃腸炎病毒雙抗體夾心ELlSA檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（5）：364-368.

[7]尹杰，楊恒，曹三杰，等.豬傳染性胃腸炎病毒S基因B、C位點(diǎn)的克隆與表達(dá)及間接ELISA方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2015，51（1）：7-10.

[8]郭宏偉，鄭鳴，喬宏興，等.豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白原核表達(dá)和間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2016，43（9）：2296-2301.

[9]常亮，陳伯祥，楊明，等.豬傳染性胃腸炎免疫膠體金診斷試劑條的研制[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2014，33（6）：22-24.

[10]李嘉琛.豬傳染性胃腸炎病毒ELlSA抗體檢測(cè)方法的建立及膠體金免疫層析試紙條的研制[D].北京：中國(guó)獸醫(yī)藥品檢查所，2017.

[11]Paton D，Ibata G，Sands J，et al. Detection of transmissible gas-troenteritis Virus by RT-PCR and differentiati0n from porcine respirato-ry coronavlrus [J].Journal of Virological Methods，1997，66（2）：303-309.

[12]Dong L J，Zhang Y M，Lei H E，et a1 Establishment of RT—PCR fortransmissible gastroentemls virus[J]. JounaI of Northwest A&F Uni—verSity，2012

[13]王黎，李碧，周遠(yuǎn)成，等，豬傳染性胃腸炎病毒RT—PCR檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用[J]中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（2）：190一194

[14]Kim S H，Kim I J，Pyo H M，etaI Multiplex rea-time RT—PCR for theSimUltaneoUS detection and quantification Of transmissibIe gaS—troenteritis virus and porcine epidemlc diarrhea virus[J].Journal ofVirologicaIMethods，2007，146（1）：172—177

[15]Kwonil J，Junghyum K，OKjin K，et al.Dfferentiation betweenporcine epidemiC diarrhea virus and fransmissible gastroenteritiSvirus in formalin-fixed paraffin—embedded tissues by multipexRT-nesfed PCR and comparison with in situ hybridizafion[J].Journalof VirobgicaI Methods，2003，108（1）：41—47.

[16]OIga P B MultipLex nested RT-PCR for the detection of porcineenteric viruses[J]. Journa of Virological Methods，2010，165（2）：283—293

[17]Rodri guez E，Betancourt A，Relova D，efaI.DeveIopment of anested polymerase Chain reaCtion test for the diagnOSiS of transmls—sibIe gastroenteritis of pigs[J].Revue Scientifique Et Technique，2012，31（3）：1033—1044.

[18]張坤豬病毒性腹瀉多重RT-PCR診斷方法的建立和應(yīng)用及豬輪狀病毒的分離[D]武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[19]陳芳，劉惠莉，孫紅立，等多重RT-PCR檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒[J]中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，25（1）：9—12.

[20]閏若潛，安春霞，劉淑敏，等.豬傳染性胃腸炎與流行性腹瀉病毒二重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（9）：38—42

[21]Bai X H，F(xiàn)eng L，Chen J F，et al. Development of TaqMan Fluo—rescenCe QUantitative RT—PCR ASSav for Detection Of TransmissibleGastroenteritis Virus of Swine[J].Acfa Vetenrinaria Et Zootecsinica，20O7：476-481.

[22]Vemuapali R，Gulani J，Santrich C. A real-time TaqMan？RT—PCR assay With an interenaI amplification control for rapid detec-tion of transmissilble gastroenteritis virus in swine fecal samples[J].Journal of Virological Methods，2009，162（1）：231—235

[23]龔雙燕，李小璟，李幽幽，等.豬傳染性胃腸炎病毒SYBR Green 熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及在初乳檢測(cè)上的應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33（5）：1076—1081.

[24]侯月娥，伍建敏，李中圣.PEDV和TGEV雙重TaqMan熒光定量一步法RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2017.25（1）：19-25

[25] Chen Q. Li J， Fang X E，et al. Detection of swine tronsmissiblegastroenteritis coronavirus using loop-mediated isothermal amplifi-cation[J]. Virology Journal. 2010，7（1）：1-5

[26]U P C. Ren X F Reverse transcription loop-mediated isothermalamplification for rapid detection of transmissible gastroenteritis virus[J].Current Micro biology. 2011， 62（3）： 1074-1080