調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在子癇前期中的作用

王偉嘉,杜明月,官秀婷,李莉平

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510180)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期特有的高血壓綜合征，嚴(yán)重危害母嬰安全。其表現(xiàn)為孕20周后出現(xiàn)的高血壓和蛋白尿，嚴(yán)重時合并其他多器官系統(tǒng)病變，或胎兒生長受限[1]。全世界大約3%-8%的孕婦受到PE的威脅[2]。

免疫平衡在妊娠過程中扮演了重要的角色，成功的妊娠需要母體免疫細(xì)胞相互協(xié)調(diào)[3]。PE的發(fā)生和發(fā)展與先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中免疫細(xì)胞的數(shù)量或功能的變化有關(guān)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF)-α、干擾素(interferon,IFN)-γ、白細(xì)胞介素(interleukin)-6、IL-17以及氧化應(yīng)激等與PE的發(fā)生密切相關(guān)[5]。

調(diào)節(jié)性T (regulatory T,Treg)細(xì)胞是具有免疫調(diào)節(jié)功能的特定的CD4+T細(xì)胞子集。Treg細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子叉頭框p3 (forkhead box p3,Foxp3)[6]。Treg細(xì)胞還表達(dá)較高水平的CD25、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞白血病抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)[7]，以及細(xì)胞因子TGF-β和IL-10等[8]。

大量研究表明，Treg細(xì)胞可能在母胎耐受和妊娠維持中具有重要作用[9-10]。然而Treg細(xì)胞在PE發(fā)病中作用尚未闡明。有研究表明，PE患者外周血Treg細(xì)胞較正常對照組數(shù)量減少，并且免疫調(diào)節(jié)功能下降[7,11]。然而，也有研究顯示，PE孕婦外周血Treg細(xì)胞比率與正常對照組相比無明顯差異[12]。研究報道，Treg細(xì)胞亞群的免疫抑制活性較健康孕婦顯著降低[13-14]。此外，Sasaki等采用免疫組化研究方法[15]發(fā)現(xiàn)，PE患者蛻膜Treg細(xì)胞較健康孕婦明顯減少。Gharesi-Fard等[16]發(fā)現(xiàn)蛻膜Treg細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)較健康孕婦降低。

迄今為止，鮮有研究同時探討PE患者外周血、蛻膜和臍帶血Treg細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞內(nèi)因子水平。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，同時探討PE患者外周血、蛻膜和臍帶血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比率及其細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10水平，以期闡明Treg細(xì)胞在PE發(fā)生中的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，與正常孕婦比較，PE患者無論是外周血還是蛻膜Treg比率均顯著下降，并且細(xì)胞內(nèi)因子TGF-β和IL-10的水平也均明顯降低。

1 材料和方法

1.1 病例

本研究通過了廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會的審批。受試者在參加研究之前均簽署了知情同意書。實(shí)驗組由2018年1月至2018年10月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的10名PE患者組成。PE定義為妊娠20周后持續(xù)升高的血壓(收縮壓≥140 mmHg，或者舒張壓≥90 mmHg)和蛋白尿(24小時尿蛋白≥300 mg或者尿蛋白/肌酐比值≥0.3)[17]。另外選取8名正常足月孕婦作為對照組，因社會因素要求剖宮產(chǎn)結(jié)束分娩。

妊娠孕周通過早期B超確認(rèn)。排除既往高血壓病史、多胎妊娠，妊娠合并其他原發(fā)性疾病，如糖尿病、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、腎臟疾病以及肝臟疾病等。所有孕婦均未臨產(chǎn)，并均采用剖宮產(chǎn)結(jié)束分娩。實(shí)驗組和對照組臨床特征見表1。

表1 孕婦臨床特征

1.2 標(biāo)本采集及處理

在孕婦手術(shù)前30分鐘抽取外周血2 mL，乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA,BD Biosciences,San Jose,USA)抗凝。胎兒娩出后抽取臍靜脈血2 mL，EDTA抗凝。在胎盤娩出后，用于無菌紗塊擦拭胎盤附著處子宮壁，收集蛻膜組織，放置于預(yù)冷的含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,Hyclone,Los Angeles,USA)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone,Los Angeles,USA)中。

1.3 外周血和臍帶血單個核細(xì)胞的分離

外周血及臍帶血標(biāo)本使用RBC Lysis Buffer (Biolegend,San Diego,CA) 進(jìn)行裂紅處理，用PBS洗滌2次。使用6 mL50% Percoll分離液(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)重懸于15 mL離心管中，從底部緩慢加入3 mL70% Percoll分離液，800×g常溫差速離心20 min。從中間層小心吸取單個核細(xì)胞，用PBS洗滌2次。用含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。

1.4 蛻膜單個核淋巴細(xì)胞的分離

使用眼科剪剪碎蛻膜組織<1 mm3大小后，將其加入15 mL工作濃度為1 mg/mL膠原酶Ⅳ(Collagenase IV,Gibco,California,USA)和工作濃度為0.01 mg/mL DNA酶(Thermo Scientific,California,USA)的RPMI 1640培養(yǎng)基制成的消化液中。在水平搖床上以37 ℃,60 r/min消化30 min。通過300目尼龍篩網(wǎng)過濾掉剩余組織至50 mL離心管，離心后以6 mL50% Percoll分離液重懸細(xì)胞至15 mL離心管，從底部緩慢加入3 mL70% Percoll分離液，800×g常溫差速離心20 min。從中間層小心吸取單個核細(xì)胞，PBS洗滌2次，用含10% 的FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和流式細(xì)胞術(shù)

將細(xì)胞加入20孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1 mL/孔，每毫升加入終濃度分別為100 ng/mL的佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA,Biogems,USA)、500 ng/mL的離子霉素(Ionomycin,Biogems,USA)及5 μg/mL的布雷非德菌素A(Brefeldin A,BFA,Biolegend,San Diego,CA)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4 h。收集細(xì)胞并洗滌，每106細(xì)胞與PerCP/Cy5.5標(biāo)記的抗人CD4，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗人CD25及APC標(biāo)記的抗人CD127 (Biolegend,San Diego,CA)室溫避光孵育20 min。PBS洗滌2次，加入500 μL的固定液(Fixation Buffer,Biolegend,San Diego,CA)，室溫避光固定30 min。直接加入2 mL細(xì)胞內(nèi)染色破膜緩沖液(Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer,Biolegend,San Diego,CA)，放置2.5 min后，1 400 r/min,5 min離心2次。棄去上清，用50 μL Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer重懸細(xì)胞。與PE標(biāo)記的抗人TGF-β及PE/Cy7標(biāo)記的抗人IL-10 (Biolegend,San Diego,CA )室溫避光孵育30 min。用Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer離心洗滌1遍，再用PBS洗滌1次。加入500 μL的固定液室溫避光孵育30 min以固定細(xì)胞。同時設(shè)立與熒光標(biāo)記的同型對照抗體溫育的對照組。采用FACSCanto II流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)檢測Treg細(xì)胞(CD4+CD25+CD127-細(xì)胞)占CD4+細(xì)胞的百分率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的比率。全部樣品采用FlowJo軟件(FlowJo,LLC,Ashland,OR)進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 外周血Treg細(xì)胞百分率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的陽性率

實(shí)驗結(jié)果表明，相對于健康孕婦，PE患者外周血Treg細(xì)胞百分率顯著降低(P<0.01，圖1A-C)。另外，Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)也顯著降低(P均<0.05，圖1B，D和E)。

63.75.7226.63.96105104103102101100CD127normal100101102103104105preeclampsiaCD127105104103102101100105104103102101100105104103102101100105104103102101100105104103102101100TGF-βTGF-βIL-10IL-10100101102103104105100101102103104105100101102103104105100101102103104105100101102103104105CD25CD4CD431.168.912.088.01.1718.576.83.5231.168.910.289.8543210Treg/CD4+cell%**normalpreclampaia*403020100TGF-β+/Trcgell%normalpreclampaianormalpreclampaia*403020100IL-10+/Trcgell%ABCDE

注：A和B分別代表正常孕婦和PE患者外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)的流式圖。獨(dú)立樣本t檢驗對比正常孕婦和PE患者外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率(C)以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β (D)和IL-10 (E)的表達(dá)。*P<0.05，**P<0. 01。

圖1 外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)

2.2 蛻膜中Treg細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞的百分率以及TGF-β、IL-10的比率

蛻膜所代表的母胎界面的免疫環(huán)境是直接影響胎兒健康的重要因素。實(shí)驗結(jié)果表明，相對于健康孕婦，PE孕婦蛻膜Treg細(xì)胞百分率明顯降低(圖2C)。另外，PE孕婦蛻膜Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)也明顯降低(圖2D，2E)。

2.3 臍帶血Treg細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞的比率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)

結(jié)果表明，PE患者臍帶血中的Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比率及其細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的陽性率與健康孕婦無顯著差異。

3 討論

本研究運(yùn)用臨床標(biāo)記CD4+CD25+CD127-來代表Treg細(xì)胞，既往研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞與CD4+CD25+FOXP3+-Treg細(xì)胞流式分布相似，均發(fā)現(xiàn)在PE患者體內(nèi)降低[18]。Banham等人[19]研究發(fā)現(xiàn)以Foxp3+為標(biāo)準(zhǔn)，CD127-表達(dá)與CD4+CD25+組合能夠分選出更高純度的Treg細(xì)胞。我們研究發(fā)現(xiàn)，PE患者外周血Treg細(xì)胞百分率均較正常對照明顯減少。此結(jié)果與Darmochwal-Kolarz及Santner-Nanan等人的研究結(jié)論相同[7,20]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PE患者外周血Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)較正常孕婦顯著降低。目前暫未發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞中TGF-β和IL-10水平的研究報道，既往研究都是檢測母體血漿中TGF-β和IL-10等細(xì)胞因子，一些研究表明子癇前期母體循環(huán)中IL-10會降低[21-22]，也有研究卻發(fā)現(xiàn)無顯著差異[23]，有些研究者甚至發(fā)現(xiàn)IL-10升高[24]。血漿來源的TGF-β似乎在子癇前期中升高[25-26]，另一項研究卻發(fā)現(xiàn)無顯著差異[27]。這些差異可能源于不同的實(shí)驗方法或技術(shù)因素，另外細(xì)胞因子在人體內(nèi)可能的脈沖式釋放和半衰期短為檢測體內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生了障礙[28]。Darmochwal-Kolarz等[7]進(jìn)行的Treg細(xì)胞分離及體外功能實(shí)驗直接反映了Treg細(xì)胞的抑制功能受損。

46.86.3136.710.3105104103102101100CD127normal100101102103104105preeclampsiaCD127105104103102101100105104103102101100105104103102101100105104103102101100105104103102101100TGF-βTGF-βIL-10IL-10100101102103104105100101102103104105100101102103104105100101102103104105100101102103104105CD25CD4CD450.149.935.764.36.2118.068.57.2115.384.77.7692.2151050Treg/CD4+cell%**normalpreclampaia*806040200TGF-β+/Trcgell%normalpreclampaianormalpreclampaia*20151050IL-10+/Trcgell%ABCDE

A和B分別代表正常孕婦和PE患者蛻膜Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-G和IL-10的表達(dá)的流式圖。獨(dú)立樣本t檢驗對比正常孕婦和PE患者蛻膜Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率(C)以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β (D)和IL-10 (E)的表達(dá)。*P<0.05，**P<0. 01。

圖2 蛻膜Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)

63.75.7226.63.96105104103102101100CD127normal100101102103104105preeclampsiaCD127105104103102101100105104103102101100105104103102101100105104103102101100105104103102101100TGF-βTGF-βIL-10IL-10100101102103104105100101102103104105100101102103104105100101102103104105100101102103104105CD25CD4CD431.168.912.088.01.1718.576.83.5231.168.910.289.8543210Treg/CD4+cell%**normalpreclampaia*403020100TGF-β+/Trcgell%normalpreclampaianormalpreclampaia*403020100IL-10+/Trcgell%ABCDE

A和B分別代表正常孕婦和PE患者臍帶血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)的流式圖。獨(dú)立樣本t檢驗對比正常孕婦和PE患者臍帶血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率(C)以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β (D)和IL-10 (E)的表達(dá)。

圖3 臍帶血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率以及Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)， PE孕婦蛻膜中Treg細(xì)胞百分率和Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10比率較正常孕婦顯著降低。與我們研究類似，Jung等[29]和Hsu等[18]分別利用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)皆證實(shí)PE患者蛻膜Treg細(xì)胞百分率較正常對照顯著下降。Gharesi-Fard也發(fā)現(xiàn)PE患者蛻膜Foxp3基因的表達(dá)較正常對照顯著下降[16]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，PE患者蛻膜Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10的比率較正常對照顯著減少，說明PE患者母胎界面Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能受損。多項研究也表明母胎界面TGF-β和IL-10水平降低[30-31]。而且CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化需要高水平的TGF-β[8]，TGF-β的分泌減少進(jìn)一步影響Treg細(xì)胞的生成。

既往研究發(fā)現(xiàn)，正常孕婦臍帶血Treg細(xì)胞比率差異較大[32-33]。我們研究發(fā)現(xiàn)，PE患者臍帶血Treg細(xì)胞約占CD4+T細(xì)胞的6%，與正常對照組無明顯差異。我們研究結(jié)果與Prins等[34]的研究結(jié)果類似。與此相反，El-Chennawi等[35]研究發(fā)現(xiàn)，PE患者臍帶血中Treg細(xì)胞的比率相對于正常孕婦顯著降低。我們尚不清楚研究結(jié)果不同的原因，可能與病例的選擇或?qū)嶒炇侄蔚牟煌嚓P(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，臍帶血Treg細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10比率與正常對照組也無顯著差異。

研究表明，Treg細(xì)胞在妊娠維持和母胎耐受中具有重要作用[36]。其產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)因子IL-10和TGF-β可以通過抑制特定的NK表型和炎性細(xì)胞因子的分泌[37]，促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化，以及抑制Th17細(xì)胞的分化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[38]。

我們研究發(fā)現(xiàn)，PE患者無論是外周血還蛻膜Treg細(xì)胞百分率及其細(xì)胞內(nèi)TGF-β和IL-10水平均較正常孕婦下降，說明PE患者系統(tǒng)和母胎界面的Treg細(xì)胞數(shù)量和功能均受到顯著抑制，鑒于Treg細(xì)胞在母胎耐受和妊娠維持中的作用，我們推測Treg細(xì)胞數(shù)量和功能抑制可能在PE的發(fā)生中具有一定作用。此外，我們并未發(fā)現(xiàn)PE患者的臍帶血Treg細(xì)胞比率和細(xì)胞內(nèi)因子水平與對照組存在明顯差異。結(jié)果說明，胎兒來源的Treg細(xì)胞可能在PE的發(fā)生中并不起主要作用。鑒于PE患者試圖通過期待療法延長孕周，可能導(dǎo)致胎兒死亡和孕產(chǎn)婦并發(fā)癥增加的風(fēng)險[39]，本研究選用的病例在妊娠周期有差異性，需要進(jìn)一步探究妊娠晚期Treg細(xì)胞的差異性。