鶴壽酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

焦 玉，黃德紅，王兵娥，岳國超，張 荔

(襄陽市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 襄陽 441000)

酒劑又名藥酒。藥酒的應(yīng)用歷史悠久，發(fā)展至今已經(jīng)比較成熟，將強身健體的中藥材與酒融合在一起配制成藥酒，配制方法相對較為簡便，藥物性質(zhì)趨于穩(wěn)定。藥材成分通過蒸餾提取，將有效成分融于酒中。通過飲服或外涂達到調(diào)整亞健康、防病治病、保健延年的功效。常用提取方法有冷浸法、熱浸法、滲漉法等[1]。

鶴壽酒為我院協(xié)定方，處方由西洋參、鹿茸、枸杞子、淫羊藿等18味中藥組成，處方來源于名老中醫(yī)經(jīng)驗方。西洋參性涼，味甘、微苦，能補氣養(yǎng)陰，清熱生津。鹿茸性溫，味甘、咸，可壯腎陽，益精血，強筋骨，調(diào)沖任，托瘡毒。枸杞子味甘性平，能滋補肝腎，益津明目。全方共奏補益心腎、健脾祛濕、活血化瘀之功。為進一步研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并使其質(zhì)量可控，對其進行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

1 儀器與試藥

1.1 樣品、材料與試劑

供試驗用鶴壽酒由襄陽市中醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)，批號：20180109、20180402、20181008。缺枸杞子、西洋參和淫羊藿的陰性對照樣品溶液分別按鶴壽酒的處方和工藝制備。枸杞子對照藥材(購自南陽康正藥業(yè)有限公司，經(jīng)本院藥檢室萬宏主任藥師鑒定為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實)，西洋參(購自天濟中藥飲片有限公司，經(jīng)本院藥檢室萬宏主任藥師鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliumL.的干燥根)，淫羊藿對照藥材(購自南陽康正藥業(yè)有限公司，經(jīng)本院藥檢室萬宏主任藥師鑒定為小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.的干燥葉)，人參皂苷Rb1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110704-200420)，人參皂苷Re對照品(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，批號：MUST-11041201)，人參皂苷Rg1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110703-200726)，淫羊藿苷對照品(成都埃法生物科技有限公司，批號：ABP290020，純度98%)，葡萄糖對照品(成都埃法生物科技有限公司，批號：AB17030602，純度98%)，鶴壽酒樣品(批號：20180402)。薄層層析用硅膠G(青島海洋化工有限公司)。硫酸(分析純，武漢市中天化工有限責(zé)任公司)，苯酚(天津市勝利制藥廠)。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV-757分光光度計(上海奧普勒儀器有限公司)；TG328A型光學(xué)讀數(shù)分析天平(湘儀天平儀器廠)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；KQ2200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)。

2 薄層鑒別

2.1 枸杞子的鑒別

取樣品30 mL，水浴蒸至無乙醇味，加水20 mL使其溶解，二氯甲烷萃取2次，每次20 mL，乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇約1 mL使其溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對照藥材0.5 g，加35 mL水，加熱煮沸15 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯15 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。取缺枸杞子的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備，作為陰性樣品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照無干擾。薄層色譜見圖1。

1、2、3分別為批號20180109、20180402、20181008的樣品；4.枸杞子對照藥材；5.缺枸杞子的陰性對照品

圖1 枸杞子溶液薄層色譜

2.2 西洋參的鑒別

取枸杞子薄層鑒別項下的水溶液，加水飽和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，水洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照品溶液。另取西洋參對照藥材1 g，加40%乙醇30 mL超聲20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，水洗滌2次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。再取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的溶液，分別制成對照品溶液。取缺西洋參的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備，作為陰性樣品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述6種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶20∶11∶5)5～10 ℃放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點。陰性對照無干擾。薄層色譜見圖2。

1、2、3分別為批號20180109、20180402、20181008的樣品；4.西洋參對照藥材；5.人參皂苷Rg1對照品；6.人參皂苷Re對照品；7.人參皂苷Rb1對照品；8.缺西洋參的陰性對照品日光下檢視

1、2、3分別為批號20180109、20180402、20181008的樣品；4.西洋參對照藥材；5.人參皂苷Rg1對照品；6.人參皂苷Re對照品；7.人參皂苷Rb1對照品；8.缺西洋參的陰性對照品紫外光(365nm)下檢視

圖2 西洋參薄層色譜

2.3 淫羊藿的鑒別

取枸杞子鑒別項下的供試品溶液，另取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的暗紅色斑點；噴以三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同的橙紅色熒光斑點。陰性對照無干擾。薄層色譜見圖3。

1、2、3分別為批號20180109、20180402、20181008的樣品；4.淫羊藿苷對照品；5.缺淫羊藿的陰性對照品紫外光燈(365nm)下檢視

1、2、3分別為批號20180109、20180402、20181008的樣品；4.淫羊藿苷對照品；5.缺淫羊藿的陰性對照品噴以三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365nm) 下檢視

圖3 淫羊藿薄層色譜

3 含量測定

3.1 指標(biāo)性成分的選擇

根據(jù)鶴壽酒的功效，以及各藥材所含成分，并確定含量測定的指標(biāo)為有效部位多糖成分。采用紫外分光光度法測定多糖的含量[2]。

3.2 對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品10 mg，加水定容至100 mL容量瓶中，作為對照品溶液。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 mL置100 mL容量瓶中。再精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，加入1.5 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再緩緩加入濃硫酸定容至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在490 nm處測定吸光度。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.071 3X+0.024 5，r2=0.999 2。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4 含量測定

精密吸取樣品1 mL，加無水乙醇定容至25 mL量瓶中，精密吸取10 mL，離心10 min，棄去上清液。殘渣加水分次轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加水定容至刻度。再精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，自“加入1.5 mL 5%苯酚溶液”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中多糖的總量，計算，即得。

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，濃度為3.84 μg/mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定，連續(xù)平行測定6次，吸光度值分別為0.308、0.306、0.304、0.305、0.309、0.311，RSD值為0.86%，表明儀器精密度良好。

3.5.2 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號為20180402)，按照供試品溶液制備和顯色方法，490 nm下測定，平行試驗6次，測得結(jié)果分別為41.84、42.16、41.76、43.74、42.95、42.47 mg/mL，平均含量為42.49 mg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.77%，表明其重復(fù)性良好。

3.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品(批號為20180402)，按照供試品溶液制備方法和顯色，分別放置0 min、20 min、40 min、60 min，80 min、100 min下測定，吸光度值分別為0.528、0.527、0.534、0.532、0.535、0.538，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.79%，表明樣品在100 min內(nèi)穩(wěn)定。

3.5.4 加樣回收率試驗 精密吸取1 mL已知多糖含量為42.49 mg/mL的樣品溶液(批號為20180402)6份，加無水乙醇定容至25 mL容量瓶中，精密量取10 mL，離心10 min，棄去上清液。殘渣加水分次轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加水定容至刻度。精密吸取0.5 mL至10 mL量瓶中，精密加入0.5 mL對照品溶液(濃度為38.42 μg/mL)，再加1.5 mL 5%苯酚，搖勻，再緩緩加入7.5 mL濃硫酸，顯色30 min。在490 nm處測定吸光值。計算平均回收率為97.34%，RSD為1.65%，符合要求。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

3.5.5 樣品測定 3批樣品批號分別為20180109、2018-0402和20181008，按照供試品溶液制備方法和顯色，490 nm下測定，多糖含量分別為53.06 mg/mL、42.49 mg/mL、50.24 mg/mL。根據(jù)上述測定結(jié)果，考慮到藥材的來源，以及制劑生產(chǎn)、貯藏等因素，將平均含量下浮20%，暫定本品每1 mL含多糖不得少于38.9 mg。

4 結(jié)語

用藥酒治療疾病是中醫(yī)學(xué)中一種古老而獨特的療法，在我國已有幾千年的應(yīng)用歷史。酒的主要成分乙醇是一種良好的半極性有機溶媒，大部分水溶性物質(zhì)及極性大的物質(zhì)都能在其中溶解，中藥的多種成分如生物堿、有機酸、樹脂、糖類等均較易溶解于乙醇中[3]。鶴壽酒系將低濃度白酒采用滲漉的方法提取，其有效成分能溶解其中，達到治療疾病、強身健體的作用。

按照處方的方解及君臣佐使的順序，對其進行薄層色譜鑒別。分別以甘氨酸為對照品考察了制劑中的鹿茸，黃芪對照藥材和黃芪甲苷為對照品考察了黃芪，金絲桃苷為對照品考察了菟絲子，均未顯示出與對照品相同的斑點，因此不作為鑒別指標(biāo)。

在含量測定預(yù)實驗中，對離心次數(shù)進行了考察。精密吸取樣品1 mL，加無水乙醇定容至25 mL容量瓶中，精密吸取10 mL，離心10 min，棄去上清液。殘渣加乙醇10 mL混勻，再次離心10 min，發(fā)現(xiàn)未有沉淀，表明1次離心已沉淀完全。

對顯色系統(tǒng)進行了考察，分別考察了濃硫酸-苯酚系統(tǒng)，即先加入1.5 mL 5%苯酚，搖勻，再緩緩加入7.5 mL濃硫酸，和濃硫酸-蒽酮系統(tǒng)，即0.2%濃硫酸-蒽酮，490 nm下測定二者的吸光度大小，最終選擇了濃硫酸-苯酚系統(tǒng)，490 nm下檢測。

另外，對顯色時間也進行了考察，加入苯酚和濃硫酸后，分別考察了顯色時間10 min、20 min、30 min和40 min，結(jié)果表明30 min后吸光度不再變化，因此確定為顯色30 min。

本實驗結(jié)果表明，采用薄層色譜法對制劑中的枸杞子、西洋參、淫羊藿進行鑒別，采用分光光度法測定制劑中多糖的含量，方法簡便快捷，準(zhǔn)確度高，精密度好，可作為本制劑的質(zhì)量控制方法，亦可為其他復(fù)方制劑中含相同藥味的制劑標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。