葉酸靶向CdSe/CdS/ZnS熒光量子點對肝癌HepG2細胞的體外檢測

曹艷娟，石云峰，劉明芳，石繼飛

（1.內(nèi)蒙古科技大學 包頭醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)學院，內(nèi)蒙古 包頭014040；2.安陽師范學院 化學化工學院，河南 安陽455000）

肝癌是嚴重影響人類健康的一種惡性腫瘤，在全世界常見惡性腫瘤中致死率排名第三位［1］.根據(jù)臨床研究報告顯示，惡性腫瘤的死亡率高，主要是因為癌癥早期多無明顯癥狀，一旦出現(xiàn)癥狀就已經(jīng)是癌癥晚期，有些已經(jīng)轉(zhuǎn)移至臨近的組織器官，對后期的治療造成極大的困難.所以，治愈癌癥的關(guān)鍵，應(yīng)該在于早期的發(fā)現(xiàn)和治療，特別是對肝癌HepG2細胞的檢測十分必要，這將為早期診斷、致癌反應(yīng)機理的深入研究及療效評價提供更為有效的工具.

在生物學研究中，量子點得到了廣泛的關(guān)注，它具有吸收光譜相對較寬，發(fā)射光譜相對較窄，對熒光淬滅效應(yīng)有一定抗性，熒光強度高及穩(wěn)定性強等特點，主要用于細胞成像［2-4］、腫瘤定位診斷［5-6］、DNA分子檢測和生物傳感器［7-9］等領(lǐng)域.硒化鎘(CdSe)半導體納米粒子具有水溶性強、易于功能化的特殊優(yōu)點［10-11］，通過明膠等保護涂層可顯著提高其發(fā)光效率和生物相容性［12］.

葉酸受體是一種跨膜糖蛋白，與葉酸及其衍生物具有高親和性，在腫瘤細胞中過表達，是一種具有較強選擇性的腫瘤標志物，惡性腫瘤細胞比正常組織細胞表面的葉酸受體含量要高［13］.人們根據(jù)葉酸受體的這一特征,對腫瘤特異性顯像和治療展開了研究.目前,研究者用巰基乙酸包被的量子點在體外成功檢測到人卵巢癌細胞［14］.Gerard等人用葉酸對BSA-MPA量子點進行修飾，檢測到量子點成功對乳腺癌細胞進行了標記［15］.另一方面，也應(yīng)該考慮到量子點對生物系統(tǒng)的毒性，因為大多數(shù)量子點都是基于鎘(Cd)的半導體.不但核殼量子點的外殼可以減少量子點核心的Cd泄漏，而且量子點的一些生物分子涂層可以進一步降低量子點的細胞毒性.研究表明，一種常用的蛋白質(zhì)分子牛血清白蛋白(BSA)的涂層顯著地降低了細胞的毒性［16］.

本文主要研究葉酸修飾的CdSe/CdS/ZnS核殼量子點(QDs)對肝癌HepG2細胞的檢測效果.將制備的表面為羧基CdSe/CdS/ZnS量子點外包覆BSA，然后與FA反應(yīng)，形成FA-BSA-QDs，該功能化量子點可以特異性識別表面高表達葉酸受體的肝癌HepG2細胞.

1 實驗材料與方法

1.1 試劑

十八烷烯（1-octadecene，ODE）、油胺（oleylamine，OLA）、油酸（oleic acid， OAc）、三正辛基膦（trioctylphosphine，TOP）、三辛基氧化膦（Trioctylphosphine oxide，TOPO）、無水氯化鎘（Anhydrous cadmium chloride，Cd-Cl2）、乙酸鋅（zinc acetate，ZnAc2）、醋酸鎘水合物（Cadmium acetate hydrate，Cd(Ac)2·H2O）、二氧化硒（selenium dioxide，SeO2）、硒粉（selenium powder，Se）、二苯基膦（diphenylphosphine，DPP）、硫磺粉（sulfur powder ，S）、1,2-十六烷二醇（1,2-hexadecanediol，HDD）；巰基乙酸（mercaptoacetic acid,MAA）、FA、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）-carbodiimide（EDC））、二甲基亞砜（DMSO）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）；人類肝癌細胞株HepG2取自上海通派生物細胞庫，儲備液用緩沖溶液.實驗用水為去離子二次蒸餾水，其他試劑均為分析純.

1.2 CdSe/CdS/ZnS核殼型量子點的制備

本實驗參照文獻［17］合成了CdSe/CdS/ZnS水溶性核殼型量子點，具體步驟如下:采用傳統(tǒng)的方法合成了直徑為3.0 nm CdSe.純化后，殼層ZnS逐層生長.在典型的生長反應(yīng)中，將提純的核原料注入12 mL的ODE和6 mL的OLA，放入250 mL的真空圓底燒瓶內(nèi)，在40℃～50℃的條件下進行蒸發(fā)，在氮氣下加熱到120℃～130℃.將第一個0.8 mL殼層的S前體5～10 min滴加完畢，使反應(yīng)持續(xù)20 min.用同樣的方法加入相同量的Zn前體，使反應(yīng)持續(xù)20 min，以完成第一個周期.同時逐漸增加Zn的比例和反應(yīng)溫度直至200℃，當達到所需要的發(fā)射波長時，添加額外的Zn前體注入，并將粒子退火約20 min，使量子點表面富含金屬.混合物冷卻后，以-20℃的條件儲存在冰箱中.

1.3 用葉酸對CdSe/CdS/ZnS量子點進行表面修飾

在制得的表面為羧基CdSe/CdS/ZnS量子點外包覆BSA，形成BSA-QDs，然后對其表面進行處理，用羥基乙酸使其具有親水性，然后參照文獻［18］將FA和QDs表面的巰基乙酸進行化學連接.首先在4 mL BSAQDs體系中分別加入濃度均為0.05 mol/L的NHS和含EDC的DMSO溶液各0.1 mL.在室溫黑暗的條件下，磁力攪拌過夜，然后將液體樣品離心40 min.去除多余的FA、EDC等小分子物質(zhì)，得到經(jīng)過葉酸修飾的量子點，形成穩(wěn)定的FA-BSA-QDs.

1.4 細胞的培養(yǎng)及量子點標記

將人肝癌HepG2細胞和CdSe/CdS/ZnS量子點共同孵育.將人類肝癌細胞株HepG2接種于培養(yǎng)基中，在37℃下，加入10%胎牛血清(Hyclone)和1%鏈霉素，放入5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng).培養(yǎng)基每隔一天更新一次，細胞達到80%融合時進行傳代.在細胞對數(shù)生長期時加入濃度為0.05 mol/LFA-BSA-QDs溶液0.1 mL共同培養(yǎng)8 h.用冷磷酸鹽緩沖液沖洗3次，多聚甲醛固定15 min，再用磷酸鹽緩沖液沖洗，最后用共聚焦顯微鏡仔細觀察量子點與細胞的融合情況.

圖1 橙色量子點CdSe/CdS/ZnS在激發(fā)波長為370 nm和500 nm下的熒光光譜

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)體系的光譜性質(zhì)

由圖1核殼型量子點CdSe/CdS/ZnS的熒光發(fā)射光譜圖可見，該激發(fā)光的激發(fā)波長分別為370 nm和500 nm，窄縫寬度都為2.5 nm.當激發(fā)波長為370 nm的時候，在591 nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰；當激發(fā)波長為500 nm的時候，在596 nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰.

楊芳芳等研究了CdSe/CdS/ZnS的表征特性，表明雙殼層結(jié)構(gòu)的納米微粒比單一的納米粒子和單核殼層結(jié)構(gòu)的納米粒子具有優(yōu)異的發(fā)光特性，熒光強度有很大的提高［19］.圖中熒光發(fā)射峰可以看出核殼型量子點沒有單獨成核，而是在核CdSe表面外延生長.莊慶一等對量子點進行了包裹，發(fā)現(xiàn)可以減少量子點的毒性［20］.該量子點的最大熒光峰位置與激發(fā)波長有關(guān)［21］，隨著激發(fā)波長的增加，最大熒光峰位置右移.可以利用量子點的這種特性進行生物熒光標記，通過對量子點直徑的調(diào)節(jié)，得到不同波長顏色的熒光,從而來滿足生物醫(yī)學研究工作中跟蹤標記的不同要求.

2.2 透射電子顯微鏡分析

從透射電鏡照片中能夠清晰地看到，橙色量子點沒有出現(xiàn)集聚成團的現(xiàn)象，呈現(xiàn)均勻的粒徑分布，近似呈球形，其粒徑約為6 nm，該粒子的尺寸大于核量子點CdSe，詳見圖2.

圖2 CdSe/CdS/ZnS橙色量子點的透射電鏡觀測結(jié)果

2.3 共聚焦電子顯微鏡分析量子點與肝癌細胞

圖3 為葉酸修飾的核殼型量子點CdSe/CdS/ZnS與肝癌HepG2細胞在共聚焦顯微鏡下的觀測結(jié)果.橙色熒光量子點熒光強度大部分較弱且均一，有幾個量子點偏亮主要是量子點數(shù)目加入偏多，個別量子點沒有進入細胞內(nèi)部所致.橙色熒光強度較弱且均一，表明有量子點被細胞內(nèi)吞的情況發(fā)生，這有可能是普遍存在不同于受體介導的選擇性吸附的其他吸附途徑［22］.從而得出該功能化量子點對肝癌細胞具有特異性識別功能.

圖3 核殼型量子點CdSe/CdS/ZnS與肝癌HepG2細胞共聚焦顯微鏡觀測結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗采用連續(xù)的異質(zhì)外延生長法合成了CdSe/CdS/ZnS水溶性核殼型量子點，并用葉酸對該量子點進行了表面修飾.結(jié)果表明，該量子點對肝癌HepG2細胞具有特異性識別的功能.該功能化量子點有可能對其他高表達葉酸受體的腫瘤細胞也具有特異性識別功能，未來將會成為一種新型的功能化量子點材料.