生長激素改善多囊卵巢綜合癥患者卵母細(xì)胞成熟度的研究

吳正中，李雪梅*，劉蘭云，成艷君，王萍

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院，深圳 518000；2.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院，深圳 518000)

IVF-ET是臨床治療患者不孕不育的重要方法，其首要環(huán)節(jié)是利用超生理劑量的Gn進(jìn)行控制性促排卵(COH)。獲得足夠數(shù)量和質(zhì)量的卵母細(xì)胞是臨床IVF-ET治療取得成功的先決條件，而患者COH過程中對(duì)外源Gn刺激的反應(yīng)性決定了臨床可獲得卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量[1]。當(dāng)前，患者COH過程中出現(xiàn)的卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟障礙是臨床應(yīng)用IVF-ET技術(shù)不得不面對(duì)的常見難題。因此，如何優(yōu)化臨床COH方案，增強(qiáng)患者卵巢組織對(duì)外源Gn的反應(yīng)性仍然是臨床亟待解決的重要課題。

現(xiàn)有的研究表明，在卵巢反應(yīng)不良患者的COH過程中添加外源生長激素(GH)協(xié)同Gn作用，能明顯改善卵巢組織對(duì)外源Gn的反應(yīng)性，促進(jìn)卵泡募集，提高獲卵數(shù)和卵母細(xì)胞成熟度，并最終改善胚胎培養(yǎng)的結(jié)局[2]。但目前該方案對(duì)多囊卵巢綜合癥(PCOS)患者的有效性缺乏必要的研究支持。本研究通過觀察外源GH在COH過程中的輔助應(yīng)用對(duì)PCOS患者卵母細(xì)胞發(fā)育成熟和體內(nèi)相關(guān)激素與細(xì)胞因子分泌及特定基因表達(dá)的影響，揭示外源GH在COH過程中改善PCOS患者卵母細(xì)胞成熟度的應(yīng)用價(jià)值及其初步機(jī)制。

資料和方法

一、研究對(duì)象及分組

選擇2016年9月至2019年1月在深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心利用卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)進(jìn)行不孕治療的PCOS患者75例。根據(jù)患者促排卵過程中是否使用外源GH，將其分成兩組：使用GH組(44例)和未使用GH組(31例)。所有入選病例均滿足Rotterdam診斷標(biāo)準(zhǔn)(2003)[3]，排除有以下任何一種情況者：(1)有子宮內(nèi)膜異位癥、甲狀腺功能減退癥、高泌乳素血癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥或既往卵巢手術(shù)史等其他影響生育能力的疾?。?2)男女任何一方染色體異常。所有患者知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后啟動(dòng)研究。

二、方法

1.促排方案：進(jìn)入治療前一月經(jīng)周期給予口服避孕藥，至服藥第15天開始用達(dá)菲林(0.05 mg/d，益普生，法國)皮下注射至HCG注射日，一般用藥14～18 d后可達(dá)到垂體降調(diào)節(jié)目的(滿足條件：子宮內(nèi)膜≤5 mm，血清E2水平<110 pmol/L，LH<5 U/L，雙側(cè)卵巢卵泡直徑<5 mm)。在月經(jīng)周期第2～5天開始給予麗申寶(上海麗珠)促排卵，起始用藥劑量75～112.5 U/d，而后依據(jù)B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況調(diào)整給藥劑量。對(duì)選擇使用GH的PCOS患者，在開始使用麗申寶的同時(shí)注射重組生長激素珍怡(上海聯(lián)合賽爾生物)4 U/d，直至HCG日。當(dāng)超聲監(jiān)測50%卵泡平均徑線≥17～18 mm時(shí)，當(dāng)日采集患者靜脈血并肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，上海麗珠)10 000 U。36 h后，經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下取卵，并收集卵泡液和顆粒細(xì)胞。

2.卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)與授精：取卵獲得的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體于撿卵皿(G-IVF plus，Vitrolife，瑞典)中經(jīng)37℃ 、 6% CO2、5% O2和 89% N2培養(yǎng)箱體外培養(yǎng)3～4 h后，利用透明質(zhì)酸酶(Vitrolife，瑞典)脫去卵周顆粒細(xì)胞，并對(duì)所有的MⅡ卵行ICSI授精。余下的MⅠ和GV卵同等條件下繼續(xù)體外培養(yǎng)16 h，對(duì)培養(yǎng)成熟的MⅡ卵行ICSI授精。記錄并比較兩組患者在體外繼續(xù)培養(yǎng)前后MⅡ卵數(shù)、MⅠ卵數(shù)、GV卵數(shù)、總MⅡ卵率、ICSI受精率、卵裂率和優(yōu)胚率及治療周期取消率的差異。

3.激素與核酸檢測：將收集到的血液和卵泡液經(jīng)2 000 r/min 離心10 min 后取上清液，置于-80℃冰箱保存，等待統(tǒng)一送檢。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法檢測血清和卵泡液中E2、GH及胰島素樣生長因子-I(IGF-I)含量。熒光定量PCR法檢測取卵日收集的卵巢顆粒細(xì)胞上IGF-1R mRNA、GHR mRNA和StAR mRNA的基因表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

兩組患者的年齡、體重指數(shù)(BMI)、血清基礎(chǔ)性激素和抗苗勒氏管激素(AMH)水平、中重度卵巢刺激綜合征(OHSS)的發(fā)生率及進(jìn)行ICSI的病因組成均無顯著性差異(P>0.05)，而使用Gn天數(shù)和Gn總劑量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。因無可用胚胎、子宮內(nèi)膜差或預(yù)防OHSS等原因，兩組取消新鮮移植的患者數(shù)分別為22例和23例，使用GH組患者的周期取消率顯著低于未使用GH組患者(P<0.05)(表1)。其余患者經(jīng)Day3移植2枚優(yōu)質(zhì)卵裂胚后，使用GH組15例獲得臨床妊娠，而未使用GH組3例獲得臨床妊娠，兩組的臨床妊娠率分別為68.2%和37.5%。

表1 兩組患者一般資料比較[(-±s)，%]

注：與未使用GH組比較，*P<0.05

二、外源GH對(duì)PCOS患者卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的作用

取卵后離體的卵母細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)3～4 h后，比較兩組患者的MⅡ卵數(shù)、MⅠ卵數(shù)、GV卵數(shù)和總MⅡ卵率，發(fā)現(xiàn)COH過程中使用GH組患者的MⅡ卵數(shù)和總MⅡ卵率均顯著高于未使用GH組患者(P<0.05)，而MⅠ卵數(shù)和GV卵數(shù)均顯著低于后者(P<0.05)。ICSI授精后觀察兩組患者受精、卵裂和胚胎發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)與未使用GH組相比，使用GH組患者的正常受精率、卵裂率和優(yōu)胚率均顯著增高(P<0.05)。將ICSI授精后余下的未成熟卵經(jīng)體外繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，不僅每組患者的MⅡ卵數(shù)、MⅠ卵數(shù)和GV卵數(shù)均低于繼續(xù)培養(yǎng)前的對(duì)應(yīng)值，而且其總MⅡ卵率、正常受精率、卵裂率和優(yōu)胚率也均顯著低于后者的對(duì)應(yīng)值(P<0.05)；但繼續(xù)體外培養(yǎng)后各指標(biāo)在兩組患者間均沒有顯著差異(P>0.05)(表2)。

三、外源GH對(duì)PCOS患者血液與卵泡液中GH、E2和IGF-1水平的影響

利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法檢測HCG日血清和取卵日卵泡液中E2、GH及IGF-I含量，發(fā)現(xiàn)兩者中的GH和IGF-1含量無顯著性差異(P>0.05)，而血清E2含量顯著低于卵泡液(P<0.05)。使用GH組患者血清和卵泡液中上述各指標(biāo)值均高于未使用GH組患者，其中兩組間血清與卵泡液GH和IGF-1及卵泡液E2的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表2 兩組患者卵母細(xì)胞發(fā)育成熟及授精后結(jié)局的比較[(-±s)，%]

注：與未使用GH組比較，*P<0.05；與繼續(xù)培養(yǎng)前的同組別相比，#P<0.05

表3 兩組患者血清和卵泡液E2、GH及IGF-I含量的比較(-±s)

注：與未使用GH組比較，*P<0.05；與同組血清中的含量相比，#P<0.05

四、外源GH對(duì)PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞上GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA基因表達(dá)的影響

類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白(StAR)在甾體激素合成限速步驟中起關(guān)鍵性作用[4]。為了分析外源GH在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和甾體激素合成過程中的作用方式，本研究進(jìn)一步檢測了兩組患者卵巢顆粒細(xì)胞上GH受體基因GHR mRNA、IGF-1受體基因IGF-1R mRNA和類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白基因StAR mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)COH過程中使用GH組其取卵日卵巢顆粒細(xì)胞上GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA的表達(dá)較之未使用GH組均顯著增多(P<0.05)(圖1)。

五、卵泡液GH含量與其它指標(biāo)的相關(guān)性分析

結(jié)果呈現(xiàn)，卵泡液中GH含量與卵泡液IGF-1和E2水平、MⅡ卵數(shù)及顆粒細(xì)胞GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著正相關(guān)(P<0.05)。此外，卵泡液IGF-1與卵泡液E2、MⅡ卵數(shù)及顆粒細(xì)胞GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA相對(duì)表達(dá)量，以及卵泡液E2與MⅡ卵數(shù)和顆粒細(xì)胞StAR mRNA呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)(表4)。

與未使用GH組相比，*P<0.05

表4卵泡液GH含量與其它指標(biāo)的相關(guān)性分析

卵泡液GH卵泡液IGF-1卵泡液E2MⅡ卵數(shù)顆粒細(xì)胞GHR mRNA顆粒細(xì)胞IGF-1R mRNA顆粒細(xì)胞StAR mRNA卵泡液GH10.715??0.268?0.243?0.710??0.610??0.239?卵泡液IGF-10.715??10.406??0.268?0.870??0.633??0.238?卵泡液E20.268?0.406??10.358??0.1310.1690.443??MⅡ卵數(shù)0.243?0.268?0.358??10.1630.0400.230顆粒細(xì)胞GHR mRNA0.710??0.870??0.1310.16310.577??0.242?顆粒細(xì)胞IGF-1R mRNA0.610??0.633??0.1690.0400.577??10.035顆粒細(xì)胞StAR mRNA0.239?0.238?0.443??0.2300.242?0.0351

注：*在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān);**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

討 論

GH是一種蛋白質(zhì)多肽類激素，主要由垂體前葉分泌，具有促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育和細(xì)胞增殖等多種生理功能，能夠在女性生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。GH分泌不足的女性可出現(xiàn)青春期延遲或成年后卵巢對(duì)Gn的反應(yīng)性下降。在卵巢反應(yīng)不良患者的COH過程中添加外源GH能夠以更低的Gn使用劑量和更短的使用時(shí)間促進(jìn)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟[5]，增加MⅡ卵數(shù)量，并顯著提高受精率[6-7]、優(yōu)胚率[8]、可移植胚胎數(shù)[9]和臨床妊娠率[10]。

PCOS患者存在內(nèi)在性卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟障礙，常導(dǎo)致COH后的卵母細(xì)胞成熟率較低。為了探討添加外源GH的COH方案對(duì)改善PCOS患者卵母細(xì)胞發(fā)育成熟及其胚胎體外發(fā)育潛能的有效性，本研究比較了使用GH組PCOS患者與未使用GH組PCOS患者的卵母細(xì)胞離體培養(yǎng)3～4 h后其各自MⅡ卵數(shù)、MⅠ卵數(shù)、GV卵數(shù)、總MⅡ卵率和ICSI受精率及受精后胚胎發(fā)育情況的差異，發(fā)現(xiàn)與未使用GH組患者相比，使用GH組患者的MⅡ卵數(shù)、總MⅡ卵率、ICSI正常受精率、卵裂率和優(yōu)胚率均顯著升高(P<0.05)，而MⅠ卵數(shù)和GV卵數(shù)均顯著降低(P<0.05)。說明使用GH組患者得到的卵母細(xì)胞成熟度更高且其受精能力和胚胎發(fā)育潛能更好，提示該COH方案同樣適用于PCOS患者。此外，本研究發(fā)現(xiàn)COH過程中使用外源GH同樣能減少PCOS患者的Gn使用天數(shù)和總使用劑量，與劉珍等[11]結(jié)果存在差異，可能與研究所選的病例構(gòu)成不同有關(guān)。

GH的作用過程復(fù)雜，目前尚不清楚外源GH在COH過程中起作用的具體機(jī)制。以往的研究表明，GH能通過受體-配體途徑或IGF-1介導(dǎo)的途徑來促進(jìn)卵泡發(fā)育、甾體激素合成和卵母細(xì)胞成熟[12]。本研究發(fā)現(xiàn)使用外源GH的患者其血清和卵泡液GH、IFG-1和E2含量均增高，其中血清和卵泡液GH和IGF-1及卵泡液E2含量的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且卵泡液GH含量與卵泡液IGF-1和E2含量及MⅡ卵數(shù)顯著正相關(guān)，證實(shí)了外源GH的使用與患者卵泡發(fā)育、甾體激素合成和卵母細(xì)胞成熟等功能增強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。同時(shí)，通過檢測卵巢顆粒細(xì)胞GH受體GHR和IGF-1受體IGF-1R的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)取卵日使用GH組患者卵巢顆粒細(xì)胞GHR mRNA和IGF-1R mRNA的表達(dá)水平均顯著高于未使用GH組(P<0.05)，且卵泡液GH和IGF-1含量與顆粒細(xì)胞GHR mRNA和IGF-1R mRNA表達(dá)水平正相關(guān)。說明外源GH的使用提高了PCOS患者卵泡液的GH含量，后者通過上調(diào)其受體基因GHR mRNA的表達(dá)，增強(qiáng)了配體-受體通路活性，進(jìn)而促進(jìn)了機(jī)體對(duì)IGF-1及其受體的合成與分泌。研究表明，GH和IGF-1含量升高可以獨(dú)自或相互協(xié)同提高卵巢對(duì)Gn的敏感性，促進(jìn)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟[5]；GH上調(diào)受體基因的表達(dá)能調(diào)節(jié)線粒體活性和(或)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量[1，13]，且卵母細(xì)胞所處的卵泡液中GH含量越高，形成的胚胎質(zhì)量越好[14]；而升高的IGF-1還能夠抑制卵泡凋亡[15]，增強(qiáng)卵泡刺激素和芳香化酶活性，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育和甾體激素合成與轉(zhuǎn)化。

然而，進(jìn)一步比較ICSI授精后余下的未成熟卵在體外同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h后的卵母細(xì)胞成熟度及成熟MⅡ卵ICSI授精和培養(yǎng)結(jié)局，發(fā)現(xiàn)此時(shí)兩組患者的總MⅡ卵率、ICSI正常受精率、卵裂率和優(yōu)胚率均顯著低于繼續(xù)培養(yǎng)前的對(duì)應(yīng)值(P<0.05)，但兩組間比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明體外成熟的卵母細(xì)胞其成熟度、受精能力和胚胎發(fā)育潛能均顯著低于體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，且不受COH過程中是否使用GH的影響。提示外源GH改善卵母細(xì)胞成熟度的作用依賴于配體-受體途徑及IGF-1介導(dǎo)的途徑所建立的激素和細(xì)胞因子微環(huán)境。

需要指出的是，盡管本研究發(fā)現(xiàn)添加外源GH的COH方案能夠顯著改善PCOS患者卵母細(xì)胞成熟度及其胚胎體外發(fā)育潛能，但鑒于PCOS患者的臨床復(fù)雜性，是否對(duì)每位PCOS患者或者對(duì)哪些特定患者建議采用該種COH方案值得進(jìn)一步研究。