日本血吸蟲正常發(fā)育和發(fā)育阻遏雌蟲的轉(zhuǎn)錄組差異分析

程貴鳳，李肖純，秦芳林，何川川，劉金明，古少鵬，金亞美

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801 ; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗室，上海閔行200241 ; 3.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海徐匯200233)

血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種人獸共患寄生蟲病，感染者超過2億，有將近8億人面臨著感染風(fēng)險[1-3]，在我國主要流行的是日本血吸蟲病。血吸蟲是雌雄異體[4]，雌蟲只有與雄蟲持續(xù)不斷地合抱才能促進(jìn)和維持卵黃腺和卵巢的發(fā)育與成熟，才能正常產(chǎn)卵[5]。成熟雌蟲所產(chǎn)大量蟲卵隨宿主糞便排出體外造成血吸蟲病的流行，同時沉積在宿主體內(nèi)的蟲卵會引起嚴(yán)重的病理損害[6]。而單性感染的雌蟲，缺乏與雄蟲的接觸，生殖系統(tǒng)發(fā)育停滯，不能正常產(chǎn)卵。此外，當(dāng)配對的雌蟲與雄蟲分離，雌蟲將退回到未成熟狀態(tài)并停止產(chǎn)卵[7-8]。因此，研究與血吸蟲生殖發(fā)育和產(chǎn)卵相關(guān)的通路和基因，深入了解日本血吸蟲雌蟲性成熟和產(chǎn)卵的調(diào)控機(jī)制，對控制該病的發(fā)生和傳播十分重要。

本研究用RNA-seq高通量測序技術(shù)對日本血吸蟲25日齡MF和SF的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序、定量及差異表達(dá)基因的篩選，利用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)基因，尋找與雌蟲生殖發(fā)育和產(chǎn)卵相關(guān)的基因，以期為研究日本血吸蟲雌蟲的生長發(fā)育、性成熟和產(chǎn)卵機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 Prime-ScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ,購自TaKaRa生物工程有限公司；TRIZol?試劑,購自上海英濰捷基生物公司；ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.1.2 實(shí)驗動物與蟲株 日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲病研究室提供；4～6周齡雄性BALB/c小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗動物有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 25日齡MF和SF的收集 采用腹部貼片法感染小鼠，于感染25 d剖殺，以肝門靜脈灌注法收集合抱分開的雌蟲；以單釘螺逸出的尾蚴感染小鼠，25 d剖殺，結(jié)合形態(tài)觀察，收集SF蟲體，SF較MF小，所收集蟲體用PBS洗滌3 次，液氮罐凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA的提取及日本血吸蟲mRNA文庫的構(gòu)建 按照TRIZol說明書提取總RNA，并用NanoDrop1000分光光度計評估RNA的質(zhì)量?？俁NA樣品用DNA酶I處理以降解任何可能的DNA污染，使用Oligo(dT)磁珠來富集mRNA，向得到的mRNA中加適量片段化緩沖液，在高溫條件下使其片段化，再以片段化后的mRNA為模板, 合成cDNA，經(jīng)磁珠純化、末端修復(fù)、3′末端加堿基A、加測序接頭后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個文庫制備工作，并進(jìn)行測序。

1.2.3 參考基因組比對及測序評估 將測序結(jié)果與日本血吸蟲基因組數(shù)據(jù)庫比對并進(jìn)行測序飽和度分析，通過對比對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析，判定該數(shù)據(jù)是否可用于后續(xù)分析。

1.2.4 差異表達(dá)基因篩選 基因表達(dá)量的計算采用RPKM方法消除基因長度和測序量差異對計算基因表達(dá)的影響，得到的基因表達(dá)量直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異，公式為：RPKM=106C/(NL/103)，RPKM為基因表達(dá)量，C為唯一比對到該基因的讀取數(shù)，N為唯一比對到參考基因的總讀取數(shù)，L為該基因編碼區(qū)的堿基數(shù)。以│Log2Ratio│≥1, p-Value<0.001為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因，其中錯誤檢出率小于0.001。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 用BLAST將檢測到的基因與Nr(Non-redundant protein sequence database in GenBank)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得注釋信息。利用Blast2GO軟件將基因序列與GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從生物學(xué)進(jìn)程，細(xì)胞組分和分子功能這3個層面進(jìn)行基因GO注釋，并篩選出差異基因富集的顯著性GO條目；同時將基因于KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路注釋，獲得差異表達(dá)基因相應(yīng)的通路信息。

1.2.6 熒光實(shí)時定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測差異基因的轉(zhuǎn)錄水平 為驗證測序結(jié)果的可靠性，從MF和SF差異表達(dá)的基因中隨機(jī)選取5個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測。用Primer 5.0設(shè)計這些基因的特異性引物，見表1(由上海英濰捷基生物公司合成)。提取25 d MF和SF蟲體的總RNA，按Prime-ScriptRTreagent說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按SYBR?Premix ExTaqTMⅡ說明書進(jìn)行qRT-PCR，每個反應(yīng)均做三孔重復(fù)。利用ABI 7500 Software v2.0.5分析結(jié)果，以tublin基因作為內(nèi)參，得出相對于每百萬持家基因的目的基因含量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異表達(dá)基因在MF與SF的差異性分析用t-test進(jìn)行檢驗；P-values≤0.05或0.01視為差異顯著或極顯著。

表1 qRT-PCR檢測的基因序列和擴(kuò)增長度

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)分析 從MF和SF中分別獲得3 696 376和3 662 109條clean reads，且clean reads占測序總讀數(shù)的99.5%，樣品質(zhì)量良好。將clean reads數(shù)匹配到日本血吸蟲基因組數(shù)據(jù)庫，匹配率達(dá)79%左右。

2.2 測序飽和度 測序飽和度結(jié)果顯示，當(dāng)測序量達(dá)到一定值時，25天MF和SF中鑒定到的基因數(shù)量不再增加，說明測序結(jié)果是全面且飽和的，可進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)分析。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選 RNA-seq共檢測到11 171個基因。在這些基因中，以│Log2Ratio│≥1,p-Value<0.001為條件，篩選到775個在MF和SF之間顯著差異表達(dá)的基因，其中401個基因在MF中上調(diào)， 374個基因在SF中上調(diào)。

2.4 GO功能分析 從BP(Biological process, 生物學(xué)進(jìn)程)、CC(Cellular components, 細(xì)胞組分)、MF(Molecular function, 分子功能) 3個層面進(jìn)行GO注釋，如圖1所示，在生物學(xué)進(jìn)程中，差異表達(dá)基因更多的參與細(xì)胞進(jìn)程，代謝進(jìn)程和單一生物進(jìn)程。在細(xì)胞組分中，差異表達(dá)基因集中在細(xì)胞、細(xì)胞器和細(xì)胞膜中。在分子功能中，大多數(shù)差異表達(dá)基因與結(jié)合和催化活性相關(guān)。

GO功能富集分析還結(jié)合了表達(dá)模式的聚類分析，如表2所示，差異表達(dá)基因的主要生物學(xué)功能集中在：氧化磷酸化，離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，血紅素結(jié)合和鐵離子結(jié)合。

圖1 差異基因的GO注釋

GO功能分類GO功能基因數(shù)/差異基因數(shù)GO功能基因數(shù)/鑒定到的基因數(shù)P-value生物進(jìn)程 氧化還原進(jìn)程39/261(14.9%)196/3763(5.2%)4.39e-07 電子傳遞鏈21/261(8.0%)73/3763(1.9%)6.50e-06 氧化磷酸化15/261(5.7%)39/3763(1.0%)1.17e-05 單一生物進(jìn)程112/261(42.9%)1168/3763(31.0%)0.01390細(xì)胞組分 呼吸鏈13/212(6.1%)49/2953(1.7%)0.00359 膜組分66/212(31.1%)611/2953(20.7%)0.01968 膜102/212(48.1%)1078/ 2953(36.5%)0.03226分子功能 氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性23/267(8.6%)88/3952(2.2%)1.60e-06 離子跨膜45/267(16.9%)288/3952(7.3%)7.45e-06 血紅素結(jié)合8/267(3.0%)22/3952(0.6%)0.01130 鐵離子結(jié)合9/267(3.4%)31/3952(0.8%)0.02867

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG分析 本研究將所有顯著差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些差異基因富集到206個途徑。其中顯著性富集途徑涉及到代謝途徑，肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，溶酶體等，見圖2。

2.6 差異表達(dá)基因的驗證 為了驗證RNA-seq結(jié)果，從鑒定到的差異基因中隨機(jī)選擇5個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因用于qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示,這些基因在轉(zhuǎn)錄水平上也表現(xiàn)出相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，見圖3A和3B。

圖2 差異表達(dá)基因的KEGG分析

3 討論

為探索血吸蟲雌蟲的生長發(fā)育、產(chǎn)卵等機(jī)制，本研究使用RNA-seq技術(shù)對25天MF和SF的樣品進(jìn)行了大規(guī)模測序、定量及差異表達(dá)基因的篩選。經(jīng)測序飽和度分析表明測序結(jié)果是飽和且全面的，全部的clean reads數(shù)與日本血吸蟲基因組序列匹配發(fā)現(xiàn)兩組樣本的匹配率皆達(dá)79%以上，但仍有20%未知標(biāo)簽，這表明存在新的基因需進(jìn)一步鑒定。

日本血吸蟲雌蟲的性成熟和產(chǎn)卵對血吸蟲病的發(fā)生和傳播至關(guān)重要，為鑒定與這些生物學(xué)過程相關(guān)的基因，本研究測序后以│Log2Ratio│≥1,p-Value<0.001為條件，篩選出775個顯著差異表達(dá)的基因，其中MF中有401個上調(diào)基因，SF中有374個基因上調(diào)。生物信息學(xué)分析表明，鑒定的差異基因主要參與代謝過程，生物合成，細(xì)胞和運(yùn)動過程。

圖3 qRT-PCR驗證差異表達(dá)基因結(jié)果

*:P≤0.05 ; **：P≤0.01

代謝過程對血吸蟲的生長發(fā)育十分重要，本研究KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本中差異表達(dá)基因富集到的最多參與途徑是代謝過程，且參與這些代謝過程的差異基因更多地在MF中上調(diào)表達(dá)，涉及的代謝過程包括核苷酸代謝，氨基酸代謝和葡萄糖代謝。本研究富集分析發(fā)現(xiàn)參與編碼腺苷磷酸化酶、鳥苷酸激酶、天門冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和二氫轉(zhuǎn)移酶的基因在MF中上調(diào)，且已證明這些酶在日本血吸蟲核苷酸代謝的自我合成途徑中起重要作用[9-11]，這說明核苷酸代謝可為日本血吸蟲雌蟲提供所需的能量。同時，檢測到參與編碼酪氨酸酶和精氨酸酶的基因在MF中高表達(dá)，已有研究表明，酪氨酸可促進(jìn)雌蟲產(chǎn)卵[12]，而精氨酸酶有助于雌蟲自身的膠原沉積[13]。此外，葡萄糖代謝對日本血吸蟲的能量需求非常重要，它是血吸蟲生長和發(fā)育的主要來源[14]。本研究檢測到很多參與糖酵解的酶，以及參與編碼胰島素蛋白的基因在MF中上調(diào)，這表明雌蟲的生長發(fā)育與葡萄糖代謝提供的能量是不可分割的。

蛋白質(zhì)的合成在維持日本血吸蟲的正常運(yùn)動和滿足雌蟲產(chǎn)卵方面發(fā)揮重要作用，本研究檢測到差異基因編碼的大量蛋白在MF中上調(diào)，如膜相關(guān)蛋白，它們可調(diào)節(jié)囊泡的融合和對接[15]，并在血吸蟲葡萄糖吸收方面起重要作用[16]。還有熱休克蛋白，它們能保護(hù)血吸蟲免受有害環(huán)境的影響[17]。此外，差異表達(dá)基因GO富集分析發(fā)現(xiàn)，血紅素結(jié)合和鐵結(jié)合過程在MF中顯著上調(diào)，研究表明,血吸蟲可以利用自身的組織蛋白酶降解宿主的血紅蛋白為珠蛋白和血紅素，提供所需的營養(yǎng)來源，且成熟雌蟲的卵黃腺中儲存有大量的鐵，可促進(jìn)雌蟲的產(chǎn)卵[18]。

KEGG富集分析和GO功能注釋發(fā)現(xiàn)在SF中上調(diào)表達(dá)的基因多參與細(xì)胞通訊和運(yùn)動，如參與編碼肌動蛋白和肌球蛋白的基因，這些基因的高表達(dá)說明發(fā)育阻遏雌蟲運(yùn)動系統(tǒng)發(fā)達(dá)，為與雄蟲合抱做準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

本研究分析了MF和SF之間的轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)許多與雌蟲生長發(fā)育和產(chǎn)卵有關(guān)的差異基因和通路，為研究日本血吸蟲雌蟲的生殖發(fā)育機(jī)制提供基礎(chǔ)。