10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準(zhǔn)確性研究

婁海芳　張喬冶　許歡　吳飛

[摘要] 目的 探討10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準(zhǔn)確性研究，找到一種簡單、快速、有效的臨床用來診斷口腔念珠菌病的方法。 方法 于2014年1月～2017年1月期間在我院口腔科患者中選取患有口腔念珠菌病的患者100例，收集患者唾液（或含漱液）標(biāo)本和口腔黏膜脫落細(xì)胞，10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR法用于檢測標(biāo)本中白色念珠菌，比較兩種檢測方法的診斷效能（靈敏度、特異度、ROC面積及預(yù)測值等）。結(jié)果 與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的準(zhǔn)確性更高（P<0.05）。與10%KOH涂片鏡檢的結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值更高（P<0.05）。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的ROC面積值更高（P<0.05）。 結(jié)論 10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準(zhǔn)確性較高，Real-time PCR診斷效果更好，具有很高的臨床應(yīng)用價值，可快速檢測和診斷口腔念珠菌病。

[關(guān)鍵詞] 10%KOH涂片鏡檢;Real-time PCR;念珠菌病;診斷效能

[中圖分類號] R644? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）22-0035-04

[Abstract] Objective To investigate the accuracy of 10%KOH smear microscopy and Real-time PCR in the diagnosis of candidiasis infection， and to find a simple， rapid and effective method for the diagnosis of oral candidiasis. Methods 100 patients with oral candidiasis were selected from the dental patients in our hospital from January 2014 to January 2017. The saliva（or gargle） specimens and oral mucosal exfoliated cells were collected for the purpose of detecting candida albicans of specimens. 10% KOH smear microscopy and Real-time PCR were applied to diagnose efficiencies（sensitivity， specificity， ROC area， Yoden index， and predicted values） of the two assays were calculated. Results The accuracy of detection of candida albicans by Real-time PCR was higher than that of the 10%KOH smear microscopy（P<0.05）. Compared with the results of smear microscopy with 10%KOH， the sensitivity， specificity， positive predictive value， and negative predictive value of candida albicans by Real-time PCR were higher（P<0.05）. Compared with the results of smear microscopy with 10%KOH， the ROC area of candida albicans by Real-time PCR assay was higher（P<0.05）. Conclusion The accuracy of 10%KOH smear microscopy and Real-time PCR for the diagnosis of candidiasis is high. Real-time PCR has a better diagnostic effect and has high clinical value. It can rapidly detect and diagnose oral candidiasis.

[Key words] 10%KOH smear microscopy; Real-time PCR; Candidiasis; Diagnostic efficacy

最近的研究發(fā)現(xiàn)，條件致病性真菌感染越來越得到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，尤其是深部真菌病，其發(fā)病率和死亡率日益升高，威脅著患者的健康和生命。白色念珠菌（candidiasis） 是一種真菌，經(jīng)常出現(xiàn)在人體內(nèi)部，包括口腔、上呼吸道、腸道和陰道內(nèi)，其數(shù)量在健康的體內(nèi)不多，所以不會引發(fā)疾病，但是如果免疫功能下降或者正常菌群功能失調(diào)時，機(jī)體就會被真菌所感染，同時真菌還會在體液中釋放代謝物，其會被作為抗原導(dǎo)致免疫反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生特異性抗體，特異性抗體快速繁殖，生長形式也改變?yōu)檠可z相，在入侵細(xì)胞后會造成疾病。念珠菌不耐熱，在60℃環(huán)境下1 h就會死亡。白色念珠菌常寄居于正常體內(nèi)，當(dāng)機(jī)體免疫機(jī)能持續(xù)降低或體內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境已經(jīng)失調(diào)，極易引起機(jī)體患有念珠菌病。念珠菌在不同位置時可引發(fā)不同的疾病[1，2]。

念珠菌的數(shù)量與機(jī)體內(nèi)的平衡共生狀態(tài)被破壞時，念珠菌會變?yōu)榫z相，而不是原來的圓形或卵圓形，從而導(dǎo)致其在局部快速大量的繁殖，由于近年來大量的免疫抑制劑及抗生素的濫用導(dǎo)致體內(nèi)正常的菌群出現(xiàn)失調(diào)，因此白色念珠菌在臨床檢查中呈現(xiàn)感染率和發(fā)病率上升的趨勢[3，4]。由于念珠菌的感染初期，患者的癥狀不明顯，臨床表現(xiàn)亦缺乏明顯的特征性，導(dǎo)致念珠菌的臨床早期診斷率很低，可明顯影響患者的預(yù)后。

口腔念珠菌病是臨床上一種常見的多發(fā)性口腔疾病，常規(guī)的臨床診斷主要依靠患者的癥狀和體征，輔以血培養(yǎng)和組織病理檢查檢出假菌絲和大量芽孢，提示念珠菌經(jīng)實驗室的細(xì)菌檢查證實感染[5，6]。常規(guī)檢查方法雖然具有操作簡單、成本較低等優(yōu)點，但是該方法耗時較長、敏感性較低，容易造成假陰性而出現(xiàn)臨床漏診，會導(dǎo)致患者因病情延誤而最終治療失敗[7，8]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，Real-time PCR法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快捷方便，已逐步開始用于真菌病的診斷和研究[9]。本研究擬采用10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR法來實現(xiàn)臨床診斷口腔念珠菌病的感染情況的研究?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2017年1月于我院口腔科確診為口腔念珠菌病患者100例作為觀察組，診斷金標(biāo)準(zhǔn)：①均為口腔念珠菌感染;②真菌培養(yǎng)的實驗室檢查結(jié)果為陽性念珠菌感染;③2名專家一起給予臨床確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：30 d內(nèi)接受過抗真菌治療或口腔局部治療者;妊娠期或哺乳期女性;不能配合試驗者。觀察組男44例，女56例;平均發(fā)病年齡（59.68±11.35）歲;偽膜型念珠菌病14例，紅斑型念珠菌病75例，增殖型念珠菌病11例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集及實驗室處理? ①采集口腔黏膜病損區(qū)的脫落細(xì)胞：在病損區(qū)，采用一次性壓舌板反復(fù)涂刮少許黏膜脫落細(xì)胞10 次，留取2 mL唾液，12 000 r/min離心 10 min，吸取 50 μL沉淀及上清液混勻后制成口腔黏膜涂片，并收集黏膜標(biāo)本采集DNA。②唾液（或含漱液）采集：剩余唾液（或含漱液）進(jìn)行下一步的真菌培養(yǎng)鑒定，沙保氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行定量檢測;法國科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行定性檢測。

1.2.2 檢測方法及結(jié)果判讀? ①10%KOH 涂片鏡檢：采用 10%KOH 溶液消化法處理載玻片，菌絲或芽生孢子出現(xiàn)明顯的折光性判讀為陽性。②Real-time PCR法：按 DNA 提取試劑盒說明書提取念珠菌 DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并設(shè)立陽性對照和陰性對照。檢出DNA擴(kuò)增即為陽性。評價指標(biāo)包括診斷試驗的真實性（靈敏度、特異度、預(yù)測值等）及受試者工作特征曲線（ROC）下面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料滿足方差齊性和正態(tài)分布，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析和t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗與Kappa 檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。比較脫落細(xì)胞和唾液標(biāo)本與兩種檢測方法組合的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測結(jié)果

10%KOH涂片鏡檢的脫落細(xì)胞陽性結(jié)果為58%（58/100），10%KOH涂片鏡檢唾液（或含漱液）的陽性結(jié)果為34%（34/100）。Real-time PCR法檢測的脫落細(xì)胞陽性結(jié)果為92%（92/100），Real-time PCR法檢測的唾液（或含漱液）陽性結(jié)果為96%（96/100）。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的準(zhǔn)確性更高（P<0.05）。見表1。

2.2 10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測的真實性評價

10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測方法的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值結(jié)果見表2、3。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值更高（P<0.05）。

2.3 ROC曲線評價10%KOH鏡檢和Real-time PCR法

見表4。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的ROC面積值更高（P<0.05）。

3 討論

在國內(nèi)外的診斷中，根據(jù)臨床癥狀及體征結(jié)合實驗室檢查診斷口腔念珠菌病雖已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同，但仍缺乏統(tǒng)一的國際金標(biāo)準(zhǔn)[10，11]。菌絲（假菌絲、真菌絲）或芽生孢子確診時，利用涂片鏡檢或唾液培養(yǎng)等方法的耗時較長，且敏感性較低，所以致力于尋求一種及時、高效的實驗室檢測方法有利于念球菌的臨床確診和治療措施的實施[12，13]。本研究結(jié)果顯示，10%KOH涂片鏡檢脫落細(xì)胞的陽性結(jié)果為58%（58/100），唾液（或含漱液）陽性結(jié)果為34%（34/100）。脫落細(xì)胞Real-time PCR法檢測的陽性結(jié)果為92%（92/100），唾液（或含漱液）Real-time PCR法檢測的陽性結(jié)果為96%（96/100）。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的準(zhǔn)確性更高。主要由于脫落細(xì)胞10% KOH 涂片鏡檢觀察對象與背景反差小，尤其是唾液（或含漱液）標(biāo)本在離心處理后，會導(dǎo)致載玻片內(nèi)的細(xì)胞增多，增大了觀察假菌絲和芽生孢子的難度，10% KOH涂片鏡檢靈敏度最高，但實驗室檢查的特異度較低，極易受到唾液（含漱液）沉淀標(biāo)本等因素干擾[14，15]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR法可以檢測出微量的真菌DNA，己成為真菌檢測的一個研究熱點。Real-time PCR法，即實時檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法，其敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快捷方便，同時還能夠克服普通PCR不能準(zhǔn)確定量、容易污染等的不足。由于其操作簡單、快速方便、靈敏度高、污染率低等特點，近年來已經(jīng)逐步開始應(yīng)用于真菌病的診斷和研究[16，17]。本研究用DNA 提取試劑盒提取白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及兩株臨床分離菌株的 DNA，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過與標(biāo)準(zhǔn)的分子量進(jìn)行試驗觀察比較，將白色念珠菌DNA 擴(kuò)增出 500 bp 左右的特異性條帶，檢測出 1×100個/mL的白色念珠菌。本研究結(jié)果表明，與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值更高;與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的ROC面積值更高（P<0.05），從 DNA提取到 PCR 擴(kuò)增的全部過程中，提取白色念珠菌只需 6 h，縮短實驗室進(jìn)行血培養(yǎng)和組織病理檢查的時間，有效提高了臨床的診斷時效，說明Real-time PCR法檢測念球菌診斷試驗的臨床應(yīng)用價值最高，為疾病的治療爭取時間[18]。此種方法在檢測樣本中白色念珠菌的敏感度高、特異性強(qiáng)、可行性好、結(jié)果穩(wěn)定，具有快速、方便、重復(fù)性好的優(yōu)點，可以為白色念珠菌感染的早期診斷提供實驗依據(jù)[19，20]。Real-time PCR檢測法只能鑒定 6 種常見念珠菌以及檢測白色念珠菌耐藥基因突變。

本研究在嚴(yán)謹(jǐn)觀察和實驗室診斷的基礎(chǔ)上，由兩名專家共同確認(rèn)白色念珠菌的診斷，以確定其感染和非感染的情況。在最大程度上控制了臨床診斷白色念珠菌的漏診和誤診，可更好評價臨床診斷試驗的可靠性。同時采用雙盲法，判讀人員對標(biāo)本和研究對象的臨床表現(xiàn)、分組等相關(guān)信息完全不知曉，最大程度上避免了人為偏差，確保試驗結(jié)果的客觀性。本研究結(jié)果提示，10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準(zhǔn)確性較高，Real-time PCR診斷效果更好，臨床應(yīng)用價值高，可作為口腔念珠菌病診斷的治療和干預(yù)的快速檢測法，其臨床應(yīng)用前景十分良好。但是本研究無法鑒定出來具體的菌種，并且對于免疫力低下、抗真菌治療效果不佳的患者尚需進(jìn)一步的組織病理學(xué)檢查。

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（收稿日期：2019-01-14）