培養(yǎng)基組分對茵芋花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響

鄭天漢

（福建省林業(yè)局，福州350003）

茵芋（Skimmiareevesiana），又稱黃山桂，具有治療風(fēng)濕痹痛、四肢攣急、兩足軟弱等藥用價值，也是觀葉、觀花、觀果俱佳植物。張琪等［1］從成分、藥理、臨床應(yīng)用等方面探討了茵芋的藥用價值；鄭天漢等［2］利用電鏡手段觀測了茵芋的生物學(xué)特征；張洪杰等［3］分析了多脈茵芋（Skimmiamultinervia）的化學(xué)成分；鄭天漢等［4］開展了不同基質(zhì)與激素對茵芋扦插萌芽效應(yīng)的研究。由于茵芋生長在海拔1 400—2 400 m的野生環(huán)境條件下，繁殖較困難，原生種質(zhì)資源稀少，因此通過人工輔助授粉方法提高茵芋的授粉、結(jié)實率具有現(xiàn)實意義。目前，有關(guān)培養(yǎng)基組分對茵芋花粉離體萌發(fā)影響的研究未見報道。本試驗對不同培養(yǎng)基中茵芋花粉的萌發(fā)和花粉管生長情況進行研究，分析其增殖條件，以期為茵芋人工輔助授粉、種質(zhì)基因保存、異地授粉和雜交育種等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用的茵芋花粉材料來自生長健壯、無病蟲害的3年生盆栽茵芋雄株，生長于福建省洋口國有林場，平均冠幅23 cm，平均株高28 cm。于2016年3月22日即茵芋盛花期采集材料。選取飽滿剛開裂但未散粉或即將開裂散粉的花藥，用鑷子夾起花藥囊，用解剖針刺破，抖落散出花粉，將花粉收集于載玻片上備用。

利用三因素（A代表蔗糖、B代表硼酸、C代表氯化鈣）三水平（分別用1、2、3表示）設(shè)置不同的培養(yǎng)基進行花粉萌發(fā)的離體培養(yǎng)試驗，試驗方案見表1。根據(jù)方案配制27個組合的培養(yǎng)基，放入花粉并用解剖針攪拌均勻，培養(yǎng)基中含0.7%（W/V）瓊脂，pH為5.8—6.0，置于載玻片上，轉(zhuǎn)入25℃恒溫暗條件下進行花粉萌發(fā)培養(yǎng)［7-8］，每4 h檢測一次，連續(xù)檢測24 h。

表1 花粉離體培養(yǎng)試驗方案Table 1 Test scheme of pollen culture in vitro g·L-1

1.2 花粉萌發(fā)情況的顯微觀察

每處理隨機選取5個載有花粉的載玻片置于IBE2000型倒置生物熒光顯示鏡下，每個視野花粉總數(shù)要大于30粒，觀測花粉管生長情況并拍照。花粉萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為花粉管長度超過花粉粒直徑。在光學(xué)顯微鏡下用測微尺測量花粉管長度，統(tǒng)計各處理的花粉萌發(fā)率和花粉管長度?；ǚ勖劝l(fā)率＝萌發(fā)的花粉粒數(shù)/視野中花粉?？倲?shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對茵芋花粉管生長的影響

各處理的茵芋花粉管總平均長度為 252.9μm。其中，A1、A2、A3處理的平均花粉管長度分別是172.2μm、302.9μm、284.4μm，B1、B2、B3處理的平均花粉管長度分別是 263.2μm、254.6μm、239.8μm，C1、C2、C3處理的平均花粉管長度分別是 279.6μm、287.4μm、192.4μm，即蔗糖處理的平均花粉管長度為253.2μm，硼酸處理的平均花粉管長度為252.5μm，氯化鈣處理的平均花粉管長度為253.1μm。A2的平均花粉管長度是A1的1.76倍，B1是B3的1.10倍，C2是C3的1.49倍，說明不同濃度的蔗糖、氯化鈣對茵芋花粉管生長影響較大，而不同濃度的硼酸影響較小。

方差分析表明，A、B、C單因素條件下的不同濃度水平對茵芋花粉管長度的影響極顯著（表2）。不同濃度蔗糖對茵芋花粉管長度效應(yīng)表現(xiàn)為A2＞A3＞A1，說明10 g/L和15 g/L的蔗糖對花粉管生長促進效應(yīng)明顯；不同濃度硼酸對茵芋花粉管長度效應(yīng)表現(xiàn)為B1＞B2＞B3，說明花粉管長度隨硼酸濃度降低而增長；不同濃度氯化鈣對茵芋花粉管長度效應(yīng)表現(xiàn)為C2＞C1＞C3，即0.02 g/L的氯化鈣最有利于花粉管生長，0.03 g/L的氯化鈣則最不利。

表2 花粉管生長的多因素互作效應(yīng)方差分析Table 2 Variance analysis ofmulti factor interaction effects on pollen tube grow th

2.2 不同培養(yǎng)基與濃度水平對茵芋花粉管生長的交互效應(yīng)

由圖1可知，A×B×C構(gòu)成的27種培養(yǎng)基對茵芋花粉管長度的影響表現(xiàn)為A3B1C2＞A3B2C2＞A2B3C2＞A2B2C2＞A3B1C1＞A2B2C1＞A3B3C1＞A2B1C3＞A2B1C1＞A2B1C2＞A2B3C3＞A3B3C2＞A3B2C1＞A1B1C1＞A2B2C3＞A2B3C1＞A1B3C1＞A1B2C1＞A3B2C3＞A3B3C3＞A1B2C2＞A1B3C2＞A1B1C2＞A3B1C3＞A1B2C3＞A1B1C3＞A1B3C3。A3B1C2組合最有利于促進花粉管生長，其花粉管長度是最不利培養(yǎng)基的4.3倍，表明蔗糖、硼酸、氯化鈣及其濃度對茵芋花粉管長度具有明顯的影響。

圖1 A、B、C互作效應(yīng)的花粉管長度Fig.1 Pollen tube length of A，B，C interaction effect

由表2可知，A×B×C對茵芋花粉管長度的互作效應(yīng)差異顯著，A×C互作效應(yīng)差異極顯著，A×B和B×C的互作效應(yīng)差異不顯著。為進一步分析各因素及其濃度水平的互作效應(yīng)來源，分別對蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平組合進行分組分析。

由圖2可知，A1、A2、A3分別與B構(gòu)成的3個組合，各組內(nèi)的花粉管長度基本一致，結(jié)合上述蔗糖單因素分析結(jié)果A2＞A3＞A1，說明組間的花粉管長度差異是來源于不同的蔗糖濃度，由此可以認為B因素及其濃度對花粉管長度基本沒有影響。

由圖3可知，A1、A2、A3分別與C構(gòu)成的3個組合，在組內(nèi)和組間都有明顯效應(yīng)，結(jié)合上述氯化鈣單因素分析結(jié)果C2＞C1＞C3，說明A×C具有明顯組合效應(yīng)，其中A2C2和A3C2對茵芋花粉管生長的促進作用最明顯。

圖2 A、B互作的花粉管長度Fig.2 Pollen tube length of A，B interaction

圖3 A、C互作的花粉管長度Fig.3 Pollen tube length of A，C interaction

由圖4可知，B×C構(gòu)成的組合，在組內(nèi)由C3即較高濃度的氯化鈣引發(fā)差異，但在組間差異小，結(jié)合上述氯化鈣單因素分析結(jié)果B1＞B2＞B3，說明B×C組合對茵芋花粉管生長沒有實際意義。同時，由圖3和圖4可見，C3即較高濃度的氯化鈣對茵芋花粉管生長具有抑制作用。

圖4 B、C互作的花粉管長度Fig.4 Pollen tube length of B，C interaction

2.3 不同培養(yǎng)基對茵芋花粉萌發(fā)率的影響

各處理組中，A1、A2、A3處理的平均萌發(fā)率分別是33.3%、41.1%、41.9%，B1、B2、B3處理的平均萌發(fā)率分別是34.4%、40.8%、41.2%，C1、C2、C3處理的平均萌發(fā)率分別是38.4%、45.6%、32.4%。試驗所采用的3種蔗糖濃度對茵芋花粉萌發(fā)率效應(yīng)表現(xiàn)為A3＞A2＞A1，即茵芋花粉萌發(fā)率隨著蔗糖濃度增加而提高，而且A3、A2的萌發(fā)率分別比A1高25.8%、23.4%，A3的萌發(fā)率僅比A2高2.0%，說明5 g/L蔗糖偏低，10 g/L蔗糖可作為培養(yǎng)基合理濃度。試驗所采用的3種氯化鈣濃度對茵芋花粉萌發(fā)率效應(yīng)表現(xiàn)為C2＞C1＞C3，即0.02 g/L氯化鈣促進茵芋花粉萌發(fā)作用最好，0.03 g/L氯化鈣則抑制了茵芋花粉萌發(fā)。前人研究表明［10］，細胞中98%的硼主要位于細胞壁，以酯化果膠形式存在，而在花粉管中，酯化果膠集中在花粉管頂端，使頂端存在一定的延展性以利于延伸生長，而酸性果膠遍及整個花粉管，使細胞壁有足夠的機械強度。一般情況下，花粉中硼是不足的，植物在自然授粉時由雌花柱頭和花柱內(nèi)的硼補償，在花粉離體狀態(tài)下，適宜濃度的硼處理能有效提高花粉的萌芽率。試驗所采用的3種硼酸濃度對茵芋花粉萌發(fā)率效應(yīng)表現(xiàn)為B3＞B2＞B1，即茵芋花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的增加而提高，B3、B2的萌發(fā)率分別比B1高20.0%、18.6%，B3比B2高1.0%，說明0.01 g/L硼酸偏低，0.03 g/L硼酸可作為培養(yǎng)基合理濃度。

2.4 不同培養(yǎng)基組合下茵芋花粉萌發(fā)率、花粉管長度的相關(guān)分析

A×B組合與A×C組合的茵芋花粉萌發(fā)率相關(guān)系數(shù)為0.1834，差異不顯著；A×B組合與B×C組合的萌發(fā)率相關(guān)系數(shù)為0.7599，差異顯著；A×C組合與B×C組合的萌發(fā)率相關(guān)系數(shù)為0.2239，差異不顯著。相關(guān)分析結(jié)果說明，3種組合類型對茵芋花粉萌發(fā)率的影響具有一致性，結(jié)合上述的萌發(fā)率效應(yīng)比較，表明3種組合均對茵芋花粉萌發(fā)有促進作用。

A×B組合與A×C組合的茵芋花粉管長度相關(guān)系數(shù)為0.8081，差異顯著；A×B組合與B×C組合的花粉管長度相關(guān)系數(shù)為-0.0219，差異不顯著；A×C組合與B×C組合的花粉管長度相關(guān)系數(shù)為0.4076，差異不顯著。相關(guān)分析表明，A×B組合與A×C組合對茵芋花粉管生長差異顯著，其他兩種組合則不具一致性。

萌發(fā)率與花粉管長度在A×B×C三因素構(gòu)成的27個組合的測定值相關(guān)系數(shù)為0.5812，具有顯著水平，說明蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平交互作用在茵芋花粉萌發(fā)率和花粉管長度之間具有較高的一致性。觀察花粉管生長過程，發(fā)現(xiàn)花粉管生長具有明顯趨向培養(yǎng)基營養(yǎng)液的效應(yīng)，說明蔗糖、硼酸、氯化鈣對茵芋花粉萌發(fā)和花粉管生長兩方面都發(fā)揮了作用。

由表3可見，A×B的萌發(fā)率與A×B、A×C、B×C的花粉管長度之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.6659、0.9979、0.9987，呈正相關(guān)；其中，A×B的萌發(fā)率與A×B的花粉管長度的相關(guān)性不顯著，A×B的萌發(fā)率與A×C、B×C的花粉管長度的相關(guān)性表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)；說明A×B的萌發(fā)率與A×B、A×C、B×C的花粉管生長都具有一致性，其中A×B的萌發(fā)率與A×C、B×C的花粉管生長具有極顯著共同趨向。A×C的萌發(fā)率與A×B、A×C、B×C的花粉管長度的相關(guān)系數(shù)分別為0.3812、-0.3911、-0.1238，二者之間均表現(xiàn)為不顯著的正相關(guān)或負相關(guān)。B×C的萌發(fā)率與A×B、A×C、B×C的花粉管長度之間表現(xiàn)為不顯著的負相關(guān)。說明不同組合之間對茵芋花粉萌發(fā)率和花粉管生長的影響均具有不一致的效應(yīng)，負相關(guān)說明有利于花粉萌發(fā)卻抑制花粉管生長，反之亦然。

表3 萌發(fā)率與花粉管長度在組合間的相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis between germ ination rate and pollen tube length in combination

3 結(jié)論

本試驗表明，不同濃度的蔗糖、硼酸、氯化鈣對茵芋花粉管長度有顯著影響。具體為各因素在水平之間差異明顯，其中不同濃度的蔗糖、氯化鈣對茵芋花粉管生長影響較大，不同濃度的硼酸影響較小；三因素及其水平之間的交互效應(yīng)明顯，A3B1C2組合的花粉管最長（398.8μm），A3B2C2組合次之（364.4μm）；最優(yōu)培養(yǎng)基A3B1C2的花粉管長度是最差培養(yǎng)基A1B3C3（92.8μm）的4.3倍，是最優(yōu)單因素培養(yǎng)基（A2）花粉管長度的1.32倍，是最優(yōu)雙因素培養(yǎng)基（A3C2）花粉管長度的1.14倍，表明蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素組合對茵芋花粉管長度的影響十分明顯。綜合分析培養(yǎng)基組分對茵芋花粉管生長影響的主次作用，表現(xiàn)為氯化鈣發(fā)揮主因素作用，硼酸發(fā)揮次因素作用，蔗糖發(fā)揮輔助作用。

蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平互作下，對茵芋花粉萌發(fā)率和花粉管生長的影響效應(yīng)具有較強一致性，蔗糖、硼酸、氯化鈣對于茵芋花粉萌發(fā)和花粉管生長兩方面都發(fā)揮了作用。A×B、A×C、B×C的雙因素組合中，對茵芋花粉萌發(fā)率的影響具有一致性，對茵芋花粉管生長的影響則不具一致性。

致謝：阮偉倫院士對茵芋課題研究技術(shù)方案給予指導(dǎo)，何國生教授、黃青山高工、華偉平講師參與茵芋野外種質(zhì)調(diào)查與材料提取，阮淑明副教授參與茵芋花粉萌發(fā)試驗，特此感謝！