利用金槍魚頭提取硫酸軟骨素的工藝研究

許國平 王云鵬

（南京中科藥業(yè)有限公司 江蘇 南京 211102）

硫酸軟骨素又稱之為Chondroitin sulfate，主要是來自于一些動物軟骨組織內(nèi)部的一種非常重要的酸性黏多糖—糖胺聚糖，硫酸軟骨素是構(gòu)成動物的軟骨組織、腿皮膚等各種組織的重要構(gòu)成部分。在最近幾年的發(fā)展過程當(dāng)中，隨著對硫酸軟骨素的研究程度不斷深入，從中發(fā)現(xiàn)了硫酸軟骨素具有良好的抗凝、抗炎、抗血栓以及緩解心肌耗氧量等功效，對促進(jìn)冠狀動脈的循環(huán)、降低血脂含量以及防止血管硬化等都有著至關(guān)重要的作用，同時對于人們常有的冠心病、動脈硬化、心肌缺氧以及心肌梗塞等疾病都有著良好的治療效果。除此之外，硫酸軟骨素還具有良好的保水性能、保膠性能以及超黏性能，是很多化妝品以及男性保健品的重要材料。現(xiàn)階段，硫酸軟骨素主要來源是在一些家禽或者是鯊魚的軟骨質(zhì)當(dāng)中，但是因?yàn)檫@些原材料的提取數(shù)量比較有限，同時在整個提取過程當(dāng)中的經(jīng)濟(jì)成本較高，造成了硫酸軟骨素，在原料獲取上較難，同時價格較高無法得到普及的應(yīng)用。

1.金槍魚頭原材料的獲取

為了有效尋找到成本更低、同時反應(yīng)原料更容易得到的材料和方法至關(guān)重要，經(jīng)過相關(guān)研究人員研究得出使用金槍魚頭作為原料，可以有效提取出硫酸軟骨素。而在金槍魚頭的研究工作當(dāng)中，主要是以氨基酸礦物質(zhì)或者是動物體內(nèi)存在的其他活性物質(zhì)來進(jìn)行提取，而對于硫酸軟骨素的研究成果上還沒有正式的報道。同時在現(xiàn)階段，世界上金槍魚的年產(chǎn)量，保持在350萬t～450萬t之間，總產(chǎn)值可以達(dá)到30億美元以上，其中大部分的金槍魚被用來制成生魚片或者是直接加工成金槍魚罐頭，在加工過程當(dāng)中會生成大量的下腳料，比如金槍魚的魚頭、內(nèi)臟以及魚皮等，這些下腳料占到了金槍魚總質(zhì)量的50%以上。

2.利用金槍魚頭提取硫酸軟骨素的特點(diǎn)

在硫酸軟骨素的提取方式上主要包含了濃堿提取法、稀堿濃鹽提取法、稀堿提取法以及稀堿酶解提取法等。稀堿提取硫酸軟骨素，蛋白質(zhì)雜質(zhì)多，含氮量高，樣品溶液易渾濁，但可獲得較完整的ChS分子。堿濃度高，提取液中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，產(chǎn)品含氮量低，但硫酸軟骨素容易被降解而改變分子大小和結(jié)構(gòu)，并且濃堿法造成環(huán)境污染嚴(yán)重。因此多用稀堿法來避免堿濃度過高引起的產(chǎn)品嚴(yán)重降解。稀堿濃鹽法和稀堿稀鹽法是通過增加離子強(qiáng)度進(jìn)一步促進(jìn)粘多糖-蛋白質(zhì)的解離，并促使蛋白質(zhì)在鹽析作用下沉淀。其中比較常用的是稀堿酶解提取的方式，在整個提取過程當(dāng)中周期較長，通過超聲輔助提純法，主要是使用超聲波所存在的空化作用，讓整個物料的周圍形成一個大小不同的空穴，通過這種處理方式可以有效提高硫酸軟骨素的提取效率[1]。和常規(guī)的堿酶提取法相比，硫酸軟骨素在提取過程當(dāng)中純度的大小并沒有非常明顯的變化，但是通過超聲輔助的方式可以有效縮短整個硫酸軟骨素的提取時間，同時還實(shí)現(xiàn)了對整個酸酸軟骨素提取質(zhì)量的上升，對后續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)起到了良好的保障作用。

3.利用金槍魚頭提取硫酸軟骨素的實(shí)驗(yàn)材料和工藝研究

3.1 提取材料與設(shè)備

金槍魚頭材料主要采購于當(dāng)?shù)氐暮？谑袌?，其中大部分的金槍魚肉都制作成金槍魚罐頭，而金槍魚的魚頭經(jīng)過冷凍之后來進(jìn)行原材料的備用；其次還需要準(zhǔn)備一定量的復(fù)合蛋白酶。在實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中，主要使用到的儀器設(shè)備為：1臺超聲波清洗機(jī)、1臺1012型電熱鼓風(fēng)干燥箱、1臺分光光度計、1臺SF-200粉碎機(jī)、1臺電子天平、1臺冰箱。

3.2 預(yù)處理過程

整個實(shí)驗(yàn)過程主要分為預(yù)處理過程、超聲波處理過程、堿液提取過程、蛋白沉淀過程、反應(yīng)液抽取過程、酶解過程吸附過程以及最后的測定工作過程。將冷凍的金槍魚頭在冰箱中取出，同時將冷凍狀態(tài)下的金槍魚頭進(jìn)行解凍，放置在80攝氏度的恒溫水當(dāng)中進(jìn)行加熱，1小時之后將其撈起洗凈，并且將金槍魚頭當(dāng)中的多余雜質(zhì)進(jìn)行去除，放置在電熱鼓風(fēng)干燥箱當(dāng)中，將溫度調(diào)至到65攝氏度，干燥4小時，魚頭完全干燥完成之后取出粉碎，得到的魚骨頭粉放置在冰箱中保存?zhèn)溆肹3]。

3.3 超聲、酶處理處理

在超聲處理工作當(dāng)中需要稱取1克魚骨頭粉，然后在5毫升的石油醚當(dāng)中浸泡5分鐘，完成之后將混合液進(jìn)行充分的震蕩和靜置，防止石油醚出現(xiàn)不良泄露問題。依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)要求，需要將混合液當(dāng)中加入一定量的氫氧化鈉溶液，然后對該溶液進(jìn)行超聲波處理。

在超聲波處理完成之后需要取出燒杯，然后在燒杯當(dāng)中加入10毫升相同濃度大小的氫氧化鈉溶液，同時在35攝氏度的水溫環(huán)境中浸泡1小時，其中每間隔15分鐘需要進(jìn)行一次有效的攪拌。蛋白沉淀過程當(dāng)中需要取出反應(yīng)燒杯，并且將反應(yīng)溶液的PH值調(diào)到2～3之間，有效的去除內(nèi)部的酸性蛋白物質(zhì)，完成蛋白沉淀之后需要將混合液的PH值調(diào)到綜合狀態(tài)，然后將混合液進(jìn)行靜止，再抽取一定量的體積溶液[4]。

在酶解過程當(dāng)中需要依照混合液的體積分?jǐn)?shù)，向?yàn)V液當(dāng)中添加2%的復(fù)合蛋白酶，同時在50攝氏度的溫水環(huán)境下，浸泡兩小時時間，保持PH值為7.0左右，等到酶解過程完成之后，再將溫度調(diào)到85攝氏度，消除反應(yīng)蛋白酶物質(zhì)。完成該項(xiàng)操作之后需要取出混合液進(jìn)行冷卻，然后依照2%的添加量直接向其中加入一定量的活性炭，并且在65攝氏度的環(huán)境下吸附，20分鐘之后進(jìn)行過濾操作。在測定過程當(dāng)中，必須要保證整個混合液的澄清，同時使用分光光度法，對混合液當(dāng)中的硫酸軟骨素含量大小進(jìn)行測量。

3.4 質(zhì)量濃度對提取效率的影響

在使用硫酸軟骨素的測量過程當(dāng)中，需要對所獲得的參數(shù)進(jìn)行曲線繪制，依照參考文獻(xiàn)的測定方法，在525納米的波長處理過程當(dāng)中，以吸光度作為縱向坐標(biāo)，以硫酸軟骨素的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，然后繪制出相應(yīng)的曲線，具體如圖1所示。通過圖1可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度保持在0.00g/ml～0.30g/ml的范圍內(nèi)，具有良好的線性對應(yīng)關(guān)系。通過對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析可以看出混合液的藥液比值大小對硫酸軟骨素的提取率影響比較明顯[5]。

圖1 硫酸軟骨素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.5 料液比對提取率的影響

從圖2當(dāng)中可以看出，在減提取時間達(dá)到60分鐘范圍內(nèi)，堿的提取溫度為35攝氏度，超聲處理時間超過30分鐘以上時，可以以1：10、1：20、1：30、1：40、1：50（g/m L）料液比，分別來進(jìn)行硫酸軟骨素的提取，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可以看出，在1：10～1：20之間硫酸軟骨素的提取效率會直接隨著料液比的上升而上升，分析這一原因主要是因?yàn)樵诹蛩彳浌撬氐奶崛∵^程當(dāng)中，其中溶質(zhì)的濃度會慢慢朝著低濃度的方向上不斷擴(kuò)散，同時在料液當(dāng)中可以適當(dāng)?shù)奶岣咴虾土蛩彳浌撬刂g的溶液濃度差值，通過這種處理方式可以有效提高整個硫酸軟骨素的提取效率。但是在1：20之后因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和多糖在混合液的反應(yīng)，使料液當(dāng)中具有比較明顯的水溶解性，同時在料液比值的增大條件下，混合液當(dāng)中的雜質(zhì)會不斷上漲，進(jìn)而硫酸軟骨素在提取過程當(dāng)中的含量也在不斷降低。因此，對整個硫酸軟骨素的提取效率也有所下降，在1：30、1：40、1：50的區(qū)間當(dāng)中，對硫酸軟骨素的提取效率基本上保持一個平衡的狀態(tài)，增加料液比的意義相對不是非常明顯。因此通，過綜合分析可以看出選擇1：20的料液比來進(jìn)行硫酸軟骨素的提取更加的經(jīng)濟(jì)合理[6]。

圖2 料液比對提取率的影響

3.6 堿濃度對提取率的影響

堿濃度的影響對提取率的影響如圖3所示，通過圖3當(dāng)中的顯示可以得出，在料液比為1：20的情況下，其中堿提取的時間為60分鐘，同時堿提取的溫度為35攝氏度，超聲處理時間為30分鐘的情況下，分別向其中加入0.5%、1.0%、1.5 %、2.0%、2.5%的堿濃度來進(jìn)行硫酸軟骨素的提取，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析可以看出，在處于0.5%～2.0%之間的堿濃度條件下，硫酸軟骨素的實(shí)際效率會隨著堿濃度的上升而上升，但是在0.2%之后，整個提取效率上盡管有著明顯的降低，但是因?yàn)樵诟邼舛鹊膲A性條件下，屬于長鏈還原糖在堿性條件下會慢慢生成，糖酸而出現(xiàn)硫酸軟骨素的降解，進(jìn)而直接影響到了整個硫酸軟骨素的提取效率。綜合以上分析可以得出采用2.0%的堿濃度，對硫酸軟骨素的提取效率影響更加明顯。

圖3 減濃度對提取率產(chǎn)生的影響

4.結(jié)束語

在本次實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中可以使用價格更加低廉，同時原材料更加容易獲得的金槍魚頭作為主要的反應(yīng)原料，在使用稀堿和酶解的方式進(jìn)行有效的結(jié)合，通過超聲輔助提取的方法對金槍魚頭當(dāng)中的硫酸軟骨素進(jìn)行提取和分析，在單因素的實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)之上，通過正交實(shí)驗(yàn)的方式，對整個硫酸軟骨素的提取過程進(jìn)行合理的優(yōu)化和對比分析，以此來為金槍魚綜合使用提供出良好的參考。