在線固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法測定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺

劉 欣， 梁夢潔， 張承明， 王 晉， 黃海濤， 陳建華，李雪梅， 孔維松， 楊葉昆， 許 永， 楊光宇， 李 晶*

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明 650106；2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明 650500)

煙草特有亞硝胺(Tobacco Specific N-nitrosamines，TSNAs)是由煙草內(nèi)源性生物堿與硝酸鹽及亞硝酸鹽通過亞硝化作用產(chǎn)生的一類具有致癌性化合物，它是卷煙煙氣中可能誘發(fā)癌癥的主要活性成分之一。目前研究較多的4種TSNAs主要是：N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(N-甲基亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)和N-亞硝基假木賊堿(NAB)[1 - 2]。其中，國際癌癥組織(IRAC)已將NNK與NNN列為I類人體致癌物[2]，我國煙草行業(yè)也將NNK列為7種主要有害成分之一[3]。由于TSNAs在卷煙煙氣中的釋放量水平一般在納克/支，而煙氣基質(zhì)又十分復(fù)雜，想要對卷煙主流煙氣中的TSNAs含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析較為困難。因此，準(zhǔn)確、快速的測定卷煙煙氣中TSNAs的含量對提高卷煙產(chǎn)品的吸食安全性以及吸煙對健康的危害研究均具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，關(guān)于TSNAs的檢測方法主要有氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)[4 - 5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS)[6 - 8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用法[9 - 11]等。其中，由于TEA是專一性的檢測器，對TSNAs具有較好的選擇性，因此GC-TEA法應(yīng)用最為廣泛，但是該方法靈敏度較低，分析時間過長；LC-MS/MS法的靈敏度和選擇性均高于GC-TEA法，但其儀器維護成本高，且噪音偏高；而GC/MS法由于其卓越的色譜分離能力，已逐漸成為測定卷煙主流煙氣中TSNAs的常用方法，但由于煙氣樣品基質(zhì)復(fù)雜，在測定TSNAs前需要進(jìn)行柱層析或固相萃取凈化操作，樣品前處理過程十分繁雜費時。針對上述方法在測定TSNAs中存在的不足，本研究建立了一種簡單、快速的測定卷煙主流煙氣中TSNAs含量的GC/MS法，具體是在凝膠凈化-氣相色譜聯(lián)用儀中將堿性氧化鋁固相萃取柱替代凝膠凈化柱，通過大體積進(jìn)樣將樣品富集在固相萃取柱上，再用洗脫液進(jìn)行反向洗脫，此時就可以將富集的TSNAs洗脫下來，待排干溶劑后再進(jìn)行氣相色譜/質(zhì)譜分析。在本文改進(jìn)的方法中，樣品的固相萃取凈化可在線完成，萃取溶液可直接進(jìn)樣分析，前處理過程十分簡單、方便，且進(jìn)樣體積大幅度增加，檢測靈敏度相比常規(guī)方法大幅提高。該方法旨在為分析卷煙煙氣中TSNAs的含量提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

QP 2010 Plus在線GPC(LC-20AD)-GC/MS聯(lián)用儀(日本，Shimadzu公司)；SM450直線型吸煙機(英國，CERULEAN公司)；YQ-1001C型超聲波清洗機(上海易凈超聲波清洗設(shè)備廠)；AE240電子分析天平(感量0.1 mg，瑞士Mettler公司)；球形氧化鋁(10 mm×2.0 mm，3～5 μm，德國Mecker公司)，通過勻漿法裝填制成在線固相萃取柱。

標(biāo)準(zhǔn)品：NNK、NNN、NAT、NAB(純度均≥98%，加拿大TRC公司)；內(nèi)標(biāo)物：NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4(純度均≥99%，加拿大TRC公司)；二氯甲烷、甲醇(均為色譜純，美國Fisher公司)。

1.2 實驗方法

圖1 在線固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of on-line SPE and GC/MS system

1.2.1 在線固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法檢測系統(tǒng)在線固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示：整個系統(tǒng)主要由閥A、閥B、固相萃取柱、泵A、泵B和GC-MS分析系統(tǒng)組成，泵A主要負(fù)責(zé)輸送流動相A，泵B主要負(fù)責(zé)輸送流動相B，固相萃取柱為堿性氧化鋁在線固相萃取柱(10 mm×2.0 mm，3～5 μm，理論萃取容量為5 mg)；流動相A：二氯甲烷；流速：0.2 mL/min；流動相B：二氯甲烷-甲醇(92∶8)；流速：0.2 mL/min。

閥切換及操作過程：(1)樣品富集及凈化：色譜進(jìn)樣后(進(jìn)樣量200 mL)，流動相A通過泵A推動樣品進(jìn)入固相萃取柱進(jìn)行富集，由閥A的1口進(jìn)入，2口流出，2口與4口之間連接有固相萃取柱，流向為：1→2→4，經(jīng)閥A的3口進(jìn)入閥B的3口，最后從閥B的5口排入廢液。(2)樣品洗脫：切換閥A，流動相B通過泵B反向洗脫固相萃取柱，并進(jìn)行溶劑切割，具體由閥A的5口進(jìn)入，4口流出，流向為：5→4→2，經(jīng)閥A的3口進(jìn)入閥B的3口，前0.3 min(死體積)的流出液均通過閥B的5口排入廢液，通過閥B控制切割隨后0.6 min(切割體積120 μL)的洗脫液進(jìn)入氣相色譜/質(zhì)譜進(jìn)行分析。(3)GC/MS分析：氣相色譜中配置有體積為200 μL的惰性石英管，由液相色譜切割過來的餾分進(jìn)入到惰性石英管中，經(jīng)真空蒸發(fā)排出溶劑后，再升溫氣化，由載氣輸送先后進(jìn)入預(yù)柱和分析柱，經(jīng)色譜分離后再進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測分析。(4)固相萃取柱清洗：在氣相色譜/質(zhì)譜分析過程中，前期凈化系統(tǒng)可同步完成固相萃取柱的清洗與平衡操作(流動相B通過泵B反向洗脫固相萃取柱，切換閥A平衡固相色譜柱)，清洗時間：流動相B沖洗10 min；平衡時間：流動相A沖洗2 min以上。

1.2.2 溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.1 g標(biāo)準(zhǔn)品NNN，NNK，NAT，NAB(精確至0.1 mg)，用二氯甲烷溶解并定容，配制成濃度為1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，密封貯存于—20 ℃冰箱。內(nèi)標(biāo)儲備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.1 g的內(nèi)標(biāo)物NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，加入二氯甲烷，待完全溶解后定容，得到1.0 mg/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲備溶液，密封貯存于—20 ℃冰箱。后續(xù)實驗以二氯甲烷逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，得到0.10～15 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度均為1.0 ng/mL。以二氯甲烷為溶劑，稀釋混合內(nèi)標(biāo)儲備溶液濃度至1.0 ng/mL，作為樣品萃取溶液。

1.2.3 樣品前處理及分析按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16447-2004)[12]規(guī)定的方法平衡卷煙樣品48 h，然后利用SM450型直線型吸煙機抽吸5支卷煙樣品，并根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 19609-2004)[13]中規(guī)定方法捕集煙氣，將捕集了主流煙氣總粒相物的劍橋濾片轉(zhuǎn)移至50 mL的錐形瓶中，加入20 mL樣品萃取液，超聲萃取40 min后，取上清萃取液過0.22 μm有機相濾頭后進(jìn)樣分析。

1.2.4 儀器分析條件參照文獻(xiàn)報道[6]，對色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行設(shè)置。氣相色譜系統(tǒng)的預(yù)柱為DB-5 MS柱(5 m×0.25 mm×0.25 mm)；分析柱為HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；載氣為氦氣(純度≥99.999%)；流量為1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；色譜柱升溫程序：初始溫度150 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升至190 ℃，再以2 ℃/min速率升至250 ℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI源；電離能量30 eV；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度120 ℃；掃描模式為選擇離子監(jiān)測(SIM)模式；NNK、NNN、NAT、NAB的定量離子分別為m/z177、177、159、161；其4種同位素內(nèi)標(biāo)的定量離子分別為m/z181、181、163、165。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品萃取前處理條件的選擇

二氯甲烷常用于劍橋濾片中TSNAs的萃取[4,6]，本文不再做萃取溶液的優(yōu)化選擇。利用1.2.3項下的前處理方法收集5支卷煙主流煙氣的總粒相物，利用20 mL二氯甲烷(含內(nèi)標(biāo))進(jìn)行超聲萃取。實驗結(jié)果表明當(dāng)萃取時間達(dá)35 min后，TSNAs的萃取效果已不發(fā)生變化，考慮到不同類別卷煙樣品的萃取效果，特優(yōu)選40 min作為樣品萃取時間。

2.2 固相萃取柱的選擇

將堿性氧化鋁在線固相萃取柱應(yīng)用于凝膠凈化-氣相色譜聯(lián)用儀中(替代凝膠凈化柱)，相較于凝膠凈化，提取液可以大體積進(jìn)樣，且待目標(biāo)物富集后，還可以通過固相萃取柱的反接，集中洗脫TSNAs，避免前期前處理造成目標(biāo)物峰展寬及分散，影響色譜分析；同時，實驗還對固相萃取柱的柱容量進(jìn)行了考察：實驗中裝填的固相萃取柱規(guī)格為10×2.0 mm，3～5 μm，理論萃取容量為5.0 mg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于樣品中的TSNAs含量(ng級別)，可以滿足大體積進(jìn)樣的要求。

2.3 洗脫溶劑的選擇

通過文獻(xiàn)調(diào)研[4,6]和實際分析發(fā)現(xiàn)，利用二氯甲烷作為洗脫溶劑時，樣品中的TSNAs能較好的保留在堿性氧化鋁固相萃取柱上，達(dá)到一定的凈化效果，且樣品萃取液也為二氯甲烷可以保證前處理系統(tǒng)溶劑的一致性。清洗固相萃取柱：待樣品萃取液進(jìn)樣完成富集后，利用1 mL二氯甲烷進(jìn)行固相萃取柱的清洗凈化，通過實驗發(fā)現(xiàn)，樣品完全過完柱子需1.5 min，其中樣品200 μL，包括死體積100 μL，待過完柱后，用流動相A繼續(xù)洗滌5.0 min，部分小極性雜質(zhì)被洗出；洗脫固相萃取柱：選擇二氯甲烷-甲醇(92∶8)為洗脫溶劑進(jìn)行優(yōu)化實驗，前0.3 min(死體積)的流出液均排入廢液，通過閥B切割隨后洗脫溶劑進(jìn)入氣相色譜系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)洗脫溶劑的體積達(dá)80 μL時，TSNAs回收率可達(dá)96.8%，繼續(xù)增加洗脫溶劑的體積對回收率沒有明顯的影響。為了保證方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，實驗對洗脫溶劑的體積進(jìn)行了調(diào)整，選取切割120 mL的二氯甲烷-甲醇(92∶8)進(jìn)入氣相色譜；在切割了富集部分后，繼續(xù)使用洗脫溶劑對固相萃取柱進(jìn)行清洗(10 min)，以保證固相萃取柱的清潔和可重復(fù)性。當(dāng)下一個樣品開始分析前，采用二氯甲烷平衡固相萃取柱2 min以上，即可進(jìn)行進(jìn)樣操作。

2.4 進(jìn)樣量的選擇

考察了液相色譜進(jìn)樣體積對分析結(jié)果和色譜峰寬的影響，在50～500 μL范圍內(nèi)，隨著進(jìn)樣體積的增加，氣相色譜的色譜峰略有擴寬，但不影響待測成分的完全分離，并且不同進(jìn)樣體積下各待測成分的回收率均在95%以上，具有很高的回收率。在實際樣品分析中，進(jìn)樣體積為200 μL時已完全能滿足樣品分析的靈敏度要求。因此，本方法選擇200 μL作為液相色譜進(jìn)樣量。

通過對樣品萃取時間、固相萃取柱、洗脫溶劑與進(jìn)樣量的選擇和優(yōu)化，在選定條件下，4種TSNAs實際樣品的色譜圖見圖2。

圖2 4種煙草特有亞硝胺選擇離子色譜圖Fig.2 The SIM chromatogram of four TSNAs

2.5 工作曲線、檢測限和定量限

在優(yōu)化確定的色譜條件下，分析前述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用保留時間與組分特征離子定性，內(nèi)標(biāo)法定量。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中4種TSNAs定量離子(見1.2.4項下)的峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子峰面積之比y作為縱坐標(biāo)，待測成分濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比x為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。從表1結(jié)果可知，4種待測目標(biāo)物在0.15～10 ng/mL的線性濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)>0.999，表明本方法的線性關(guān)系較好；采用3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)計算得到本方法的檢測限為0.03～0.04 ng/g，定量限為0.10～0.14 ng/g，方法靈敏度高。

表1 方法工作曲線、相關(guān)系數(shù)、檢測限及定量限

2.6 方法回收率和精密度

取已知目標(biāo)物含量的相同樣品4份，按照10、20、40 ng 3個添加水平加標(biāo)在劍橋濾片上，分別進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗的考察，按照1.2.3項下前處理方法和1.2.4項下儀器條件進(jìn)行分析，計算樣品加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示：在3個不同添加水平下，4種TSNAs的回收率在92.4%～97.5%之間，回收率結(jié)果較為理想；日內(nèi)RSD(n=7)在2.4%～3.0%之間，日間RSD(n=7)在2.8%～3.3%之間，方法穩(wěn)定。

2.7 與現(xiàn)有方法的對比

分別采用本方法與CORESTA N°63方法測定了8個烤煙型卷煙樣品主流煙氣中TSNAs的含量，并通過配對t檢驗法對上述兩種檢測方法的測定結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，兩種方法的測定結(jié)果沒有顯著性差異(p>0.05)。

3 結(jié)論

針對復(fù)雜煙氣中TSNAs含量較低的檢測難題，本研究建立了測定煙氣中4種TSNAs的在線固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜檢測方法。方法選用新型球形氧化鋁裝填的固相萃取柱進(jìn)行雜質(zhì)凈化，結(jié)合在線固相萃取模式，前處理操作簡單、凈化效率高且可在線完成。4種TSNAs的加標(biāo)回收率在92.4%～97.5%之間，日內(nèi)與日間精密度均低于3.5%，檢測限在0.03～0.04 ng/g之間，定量限在0.10～0.14 ng/g之間。本方法的靈敏度高、重復(fù)性好，可用于卷煙主流煙氣中TSNAs的高通量檢測分析。