黃芪多糖提取、純化及其應(yīng)用研究進(jìn)展

臧凱，張萍，袁彩彩，石賢才，章亞?wèn)|

(鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院 鄭州大學(xué)濟(jì)源研究院，河南 鄭州 450001)

黃芪主要分為莢膜黃芪和內(nèi)蒙古黃芪兩種，在黑龍江、內(nèi)蒙古、江西等地均有分布。黃芪性甘，微溫，在我國(guó)有2 000多年的藥用歷史，對(duì)黃芪的記載始見(jiàn)于《馬王堆帛書五十二病方》，黃芪與芍藥、甘草等復(fù)配使用可以治療疽病。

黃芪含有黃芪皂苷、多糖、蛋白質(zhì)、黃酮等有效成分，多糖是黃芪的水溶性主要成分之一[1]。黃芪多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等生理功能。黃芪多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成。由于其具有突出的生理功能，黃芪多糖已經(jīng)成為醫(yī)療、食品、養(yǎng)殖等方面的研究熱點(diǎn)。本文就黃芪多糖提取、純化及其應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為黃芪多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 黃芪多糖的提取

在黃芪多糖的提取過(guò)程中可以先用石油醚、乙醇脫脂處理，這樣可以使多糖更易溶出。黃芪多糖的提取方法有溶劑法、酶輔助法、微生物發(fā)酵法、物理強(qiáng)化法等。

1.1 溶劑法

溶劑法是工業(yè)上較常用的提取方法，操作方便、成本低但其提取時(shí)間長(zhǎng)、溫度高、會(huì)導(dǎo)致活性組分失活。表1中列舉了3種溶劑法提取黃芪多糖的提取率。

表1 溶劑法提取黃芪多糖提取率Table 1 Solvent method Astragalus polysaccharide extraction rate

1.2 酶輔助提取

酶能破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)的阻力，提高提取率。Chen等[4]比較了纖維素酶、果膠酶等8種酶對(duì)黃芪多糖的提取率，發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的效果最好，并用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝：酶量3.0%，處理時(shí)間3.44 d，處理溫度56.9 ℃，提取溶劑pH 7.8，在此條件下，黃芪多糖的提取率達(dá)到(29.96±0.14)%，與沒(méi)有酶輔助相比提高了250%。董玲玲[5]將微波和纖維素酶提取聯(lián)合使用，多糖的提取率達(dá)到16.07%。除此之外，在植物提取的過(guò)程中也常將多種酶共同使用[6]。使用酶進(jìn)行輔助提取污染小，方法簡(jiǎn)單，成本較低，但酶對(duì)環(huán)境條件的要求較高，需要嚴(yán)格控制環(huán)境條件。

1.3 微生物發(fā)酵提取

微生物發(fā)酵提取是利用細(xì)菌或真菌等微生物在代謝過(guò)程產(chǎn)生的多種酶對(duì)提取底物進(jìn)行作用。這些酶能破壞或修飾細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使中藥中的活性成分更容易釋放出來(lái)，還能將多糖降解為小分子多糖并轉(zhuǎn)化為其他類型的多糖。邊亞彬[7]優(yōu)化了非解乳鏈球菌(FGM)發(fā)酵黃芪多糖的工藝，在提取時(shí)間65 min，提取溫度80 ℃，料液比為1∶9的條件下，發(fā)酵黃芪多糖的含量為6.72 mg/mL，并證實(shí)發(fā)酵黃芪多糖能促進(jìn)小鼠骨髓原DC的成熟。蘇貴龍[8]發(fā)現(xiàn)FGM和枯草芽孢桿菌，F(xiàn)GM 固、液兩步法兩種方法均能提高發(fā)酵黃芪根、莖、葉多糖的得率。發(fā)酵提取中藥有效成分，不僅能提高提取效率，同時(shí)還能降低中藥的毒副作用。

1.4 物理強(qiáng)化法

近年來(lái)常用的物理強(qiáng)化法有超聲輔助提取、微波輔助提取、負(fù)壓空化提取等。物理強(qiáng)化法是用物理方法破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使多糖從細(xì)胞內(nèi)流出，從而達(dá)到提高提取率的目的，也是近年來(lái)植物提取中常用的方法。超聲、微波輔助提取與負(fù)壓空化提取相比，提取率較低且前人已對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，本文就不再對(duì)其進(jìn)行展開說(shuō)明。表2列舉了物理強(qiáng)化法提取黃芪多糖的提取率。

表2 物理強(qiáng)化法提取黃芪多糖提取率Table 2 Physical enhancement method Astragalus polysaccharide extraction rate

負(fù)壓空化運(yùn)用強(qiáng)烈的空化作用和機(jī)械振動(dòng)加快植物組織中有效成分進(jìn)入溶劑，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間和低溫提取[12]。既可以保護(hù)植物中的熱敏性物質(zhì)不被破壞，同時(shí)又可以減少因高溫分解而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、淀粉等大分子雜質(zhì)。Jiao等[13]對(duì)均質(zhì)輔助負(fù)壓空化提取黃芪多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在均質(zhì)時(shí)間70 s，負(fù)壓-0.068 MPa，提取溫度64.8 ℃，水料比1∶13.4，提取時(shí)間53 min的條件下提取率為16.74%。同時(shí)FTIR結(jié)果表明，此法不改變黃芪多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的熱水提取方法相比，負(fù)壓空化提取具有提取率高、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。在其他植物的提取中有將負(fù)壓空化和其他提取方法進(jìn)行連用，田莉等[14]優(yōu)化了減壓耦合超聲提取蘋果渣多酚的工藝，得到的多酚提取液的還原能力要大于超聲提取所得到的。

熱水浸提法雖然提取率低，但適用于工業(yè)化大規(guī)模提取。超聲、微波輔助提取對(duì)工藝設(shè)備要求高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。酶輔助提取高效，但對(duì)環(huán)境要求高。微生物發(fā)酵中，需要解決如何選育優(yōu)良的菌種的問(wèn)題[15]。研究表明提取溫度能通過(guò)影響黃芪多糖的結(jié)構(gòu)影響其生理活性[16]，每一種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，如何揚(yáng)長(zhǎng)避短，實(shí)現(xiàn)低溫、高效提取應(yīng)是以后黃芪多糖提取研究重點(diǎn)。

2 黃芪多糖的純化

2.1 脫蛋白

有報(bào)道表明黃芪粗多糖中蛋白質(zhì)的含量大于15%。除去蛋白質(zhì)是獲得高活性、高價(jià)值黃芪多糖產(chǎn)品的重要步驟。黃芪多糖常用的脫蛋白方法見(jiàn)表3。

表3 黃芪多糖除蛋白的主要方法及其優(yōu)缺點(diǎn)Table 3 The main methods of removing protein from Astragalus membranaceus polysaccharides and their advantagesand disadvantages

為了便于操作，提高多糖的得率，近年來(lái)通常將酶法和Sevage法聯(lián)用。胡媛媛[20]對(duì)蛋白酶和Sevayge法聯(lián)用脫蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化，在酶底比2.0%，pH 5.0，50 ℃水浴酶解24 h時(shí)效果最好，蛋白脫除率89.82%，黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)83.47%。酶法和Sevage法連用，去除蛋白質(zhì)效果好且多糖的損失率較低，同時(shí)又簡(jiǎn)化了操作。

2.2 黃芪多糖純化

2.2.1 分級(jí)沉淀法 多糖的結(jié)構(gòu)和分子量不同會(huì)導(dǎo)致其極性不同，從而導(dǎo)致它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中的溶解度不同，根據(jù)這一原理，可以依次增加有機(jī)溶劑的濃度，將不同分子量的多糖沉淀出來(lái)。在多糖的分級(jí)沉淀中乙醇是常用的一種沉淀劑。李紅發(fā)等[21]采用30%，50%，70%，75%，80%，90%的乙醇溶液對(duì)黃芪多糖進(jìn)行分級(jí)沉淀，得到6個(gè)不同組分。分別對(duì)各個(gè)組分結(jié)構(gòu)、組成及其抗氧化性進(jìn)行分析，結(jié)果表明隨著乙醇濃度的增加，得到的多糖的分子量逐漸降低，多糖中半乳糖、甘露糖和鼠李糖的含量依次升高，葡萄糖的含量依次降低，但抗氧化活性增強(qiáng)，且抗氧化活性與多糖的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.2.2 柱層析法 在黃芪多糖的分離純化中用的最廣泛的是離子交換柱層析和凝膠柱層析。離子交換柱層析主要用于多糖粗提液中單組分多糖的粗分離。依據(jù)被分離多糖的結(jié)構(gòu)、分子量的大小使用不同規(guī)格的凝膠柱層析能實(shí)現(xiàn)多糖的分離或進(jìn)一步純化。屈靜等[22]使用SephadexCL-6B凝膠柱，0.9%NaCl作為洗脫劑，對(duì)脫蛋白的黃芪多糖進(jìn)行柱層析，得到分子量為5 600 Da，含量為96.3%的均一多糖。王瑞遵[23]先用DEA-Cellulose離子交換柱層析，以0.5 mol/L NaCl為洗脫劑，將黃芪多糖進(jìn)行粗分離，得到兩個(gè)組分，之后用SephadexCL-6B凝膠柱，以0.15 mol/L NaCl為洗脫劑，對(duì)多糖進(jìn)一步純化，得到AMPSA-a、AMPSA-b、AMPSA-c、AMPSB-d 4種四個(gè)分子量且各個(gè)組分多糖均具有顯著的抗氧化作用。

2.2.3 膜分離 在常溫下進(jìn)行的膜分離過(guò)程，具有不使用有機(jī)溶劑、分離選擇性高、易于與其他方法連用等優(yōu)點(diǎn)。超濾法是20世紀(jì)60年代興起的膜分離技術(shù)，因其產(chǎn)率高且對(duì)產(chǎn)物的破壞極小，廣范地用于植物的分離提純。張慶雷[24]將超頻震動(dòng)膜過(guò)濾技術(shù)與乙醇分級(jí)沉淀法用于黃芪多糖純化，發(fā)現(xiàn)前者易得到分子量比較均一的多糖。唐雨微[25]利用不同截留量(150，100，50，20，10，6 kDa)的中空纖維膜，在0.1 MPa壓力下，將脫蛋白的黃芪多糖分成7組，經(jīng)DEAE-Cellulose和Sephadex G-100柱層析進(jìn)行分離，得到6個(gè)多糖，研究表明得到的多糖具有微生態(tài)調(diào)節(jié)功能。

目前對(duì)黃芪多糖的分離純化方法比較固定，可以參照其他多糖的分離純化工藝，以便更好的對(duì)黃芪多糖進(jìn)行純化，例如應(yīng)用膜集成技術(shù)對(duì)多糖進(jìn)行分離純化：微濾和超濾分離純化茶多糖，可以得到兩個(gè)組分。除此之外常用的膜分離法還有微濾、納濾等，在黃芪多糖的純化中應(yīng)用的較少，但已用于其他植物多糖的純化，在黃芪多糖的分離純化中可以借鑒。

3 應(yīng)用

3.1 醫(yī)療

由于黃芪多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等藥理作用。目前黃芪多糖在疾病的治療中取得了較大的進(jìn)展。在臨床上已經(jīng)用于治療腫瘤、哮喘、糖尿病方面的疾病。對(duì)其他一些疾病的治療還停留動(dòng)物試驗(yàn)階段。

3.1.1 腫瘤 高死亡率使癌癥成為全球人類健康的主要威脅。目前治療癌癥的主要方法是化療，但化療往往伴隨著一些毒副反應(yīng)，還可能產(chǎn)生耐藥性。黃芪多糖在增強(qiáng)機(jī)體免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的同時(shí)還能降低藥物的毒副作用。近年來(lái)黃芪多糖在治療癌癥方面發(fā)展迅猛。有研究表明黃芪多糖對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞，人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞具有抑制作用，可誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡[26]。楊曉嵐[27]將注射性黃芪多糖和放療結(jié)合用于胃癌的治療，聯(lián)合治療組癌癥治療率、腫瘤體積變小率分別為63.9%，59%，而對(duì)照組分別為53%，51.8%，同時(shí)聯(lián)合治療組患者的免疫、造血和肝腎的功能水平與對(duì)照組相比明顯提高。張瑩等[28]將黃芪多糖和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞聯(lián)合治療中晚期氣虛型非小細(xì)胞肺癌。疾病控制率和卡氏評(píng)分分別為聯(lián)合治療組69.4%，77.8%，對(duì)照組為36.1%，55.6%。此外黃芪多糖還可以和吉西他濱聯(lián)用，治療胰腺癌，和阿霉素脂質(zhì)體連用治療肝癌等。

3.1.2 哮喘 黃芪多糖可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和細(xì)胞因子表達(dá)，增強(qiáng)抗炎活性，從而對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病起到較好的作用。在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給哮喘患者注射黃芪多糖注射液能顯著降低患者BALF或痰液所含炎癥細(xì)胞水平[29]，維持免疫平衡，提高機(jī)體免疫能力，同時(shí)恢復(fù)肺功能，降低不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。另有研究表明黃芪多糖能通過(guò)對(duì)T淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)控作用，改善患者免疫應(yīng)激狀況，提高患者免疫力，從而提高支氣管哮喘患者治愈率[30]。

3.1.3 糖尿病 黃芪多糖能夠通過(guò)調(diào)節(jié)患者的免疫功能、減少炎癥反應(yīng)，改善患者的腎功能。鄧海鷗等[31]用黃芪多糖注射液治療老年早期糖尿病腎。賴瑜[32]研究表明，黃芪多糖和三黃化瘀湯聯(lián)合使用能降低糖尿病腎病早期患者中血清中炎癥因子血漿纖溶酶原激活物抑制因子-1的含量。

3.1.4 其他 此外黃芪多糖也可用于治療心血管、神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病。 陳添華[33]的研究表明，黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞肥大及炎癥反應(yīng)有良好的保護(hù)作用。王愛(ài)青[34]證實(shí)黃芪多糖對(duì)急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜損傷具有保護(hù)作用，與用藥劑量相關(guān)。

3.2 食品 《保健食品原料手冊(cè)》一書指出黃芪多糖可作為保健食品原料使用。周關(guān)鍵等人以黃芪多糖、銀杏葉提取物和富硒黑番茄為主要的功能成分，研發(fā)出一種對(duì)糖尿病并發(fā)癥具有防治作用的面條。邵寶平等[35]以黃芪多糖為原料研制出一種口感舒適、色澤良好具有增強(qiáng)免疫抗疲勞的功能飲料。

3.3 養(yǎng)殖

3.3.1 免疫增強(qiáng)劑 黃芪多糖能改善血清環(huán)境，激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)體內(nèi)抗體水平來(lái)增強(qiáng)疫苗的效果。Zhu等[36]通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)表明，在脾臟和頭腎組織中，炎癥細(xì)胞因子IL-1β的mRNA表達(dá)在免疫早期增加，激發(fā)Th1免疫應(yīng)答反應(yīng)，整個(gè)免疫期細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ2升高，血清中IgM明顯增強(qiáng)，黃芪多糖可增強(qiáng)黃鯰愛(ài)德華氏菌疫苗效力。

黃芪多糖作為天然的飼料添加劑不僅能提高機(jī)體的免疫力同時(shí)還能提高機(jī)體的生產(chǎn)性能。陳亞軍[37]發(fā)現(xiàn)當(dāng)黃芪多糖在飼料中的添加量為50～400 mg/kg 時(shí)，能顯著的增強(qiáng)泥鰍的非特異性免疫和抗氧化能力。這可能是由于黃芪多糖能提高白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血清中NO的含量造成的。Wu等[38]的研究證實(shí)1 g/kg黃芪多糖喂食肉雞能促進(jìn)幼年肉雞的生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，肉雞體內(nèi)淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性更高，但黃芪多糖含量過(guò)高時(shí)，則會(huì)降低消化酶的活性。

3.3.2 生殖 人工授精廣泛的應(yīng)用于現(xiàn)代豬場(chǎng)中，液氮保存精液壽命短，冷凍保存可延長(zhǎng)精液的壽命。在精液的冷凍解凍過(guò)程中，怎樣為精子建立一個(gè)強(qiáng)大的抗氧化體系已成為人們急需解決的問(wèn)題。黃芪多糖具有良好的抗氧化功能，因此黃芪多糖有可能會(huì)成為解決這一問(wèn)題的不錯(cuò)選擇。Fu等[39]研究證實(shí)黃芪多糖可以通過(guò)影響活性氧進(jìn)入環(huán)腺苷磷酸的途徑，從而對(duì)精子蛋白的去磷脂化進(jìn)行抑制。宋健[40]研究證明黃芪多糖能夠通過(guò)降低豬解凍精液活性氧的含量，提高精子的抗氧化能力，從而提高體外受精效率及胚胎發(fā)育能力。

4 討論與展望

黃芪多糖具有極高的應(yīng)用價(jià)值，目前關(guān)于黃芪多糖的研究雖然取得了很大的進(jìn)展，但還存在一些問(wèn)題如：(1)目前的很多研究并未對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行說(shuō)明，這就需要完善黃芪多糖的制備方法，借助指紋譜圖技術(shù)、相似度分析和聚類分析等技術(shù)[41]來(lái)研究黃芪多糖的結(jié)構(gòu)，制定質(zhì)量控制方案如確定其有效片段的分子量范圍；(2)黃芪多糖是保健食品原料，但目前市場(chǎng)上與黃芪多糖相關(guān)的保健品并不多見(jiàn)，可以進(jìn)一步完善黃芪多糖的作用機(jī)制，加強(qiáng)食品方面的研究力度；(3)在醫(yī)療(如神經(jīng)系統(tǒng)、心血管疾病等)方面，還只停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上，可加強(qiáng)這方面的深入研究，進(jìn)一步推動(dòng)臨床開發(fā)和應(yīng)用；(4)黃芪多糖具有清除自由基[42]的功能，有望成為抗衰老、抗氧化化妝品的活性成分。