一個(gè)辣椒胞質(zhì)雄性不育SCAR標(biāo)記的KASP轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用

張 強(qiáng),張 濤,常曉軻,韓婭楠,程志芳,劉 衛(wèi),王 彬,姚秋菊

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

辣椒是重要的蔬菜作物，品種類型繁多，適應(yīng)性廣，雜種優(yōu)勢(shì)明顯。Peterson[1]在引進(jìn)的印度辣椒品種PI164835中首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了辣椒胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)，即核質(zhì)互作型雄性不育。利用辣椒CMS是生產(chǎn)雜交種的理想系統(tǒng)，既可以免除人工去雄，節(jié)約人力，降低種子成本，提高種子純度，又可以保護(hù)育種單位的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，是辣椒雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑之一。

辣椒胞質(zhì)雄性不育(CMS)是由細(xì)胞質(zhì)不育基因(S)和細(xì)胞核不育基因(rfrf)共同控制的，可以實(shí)現(xiàn)三系雜交配套，生產(chǎn)中既能篩選到保持系，又能找到恢復(fù)系，從而實(shí)現(xiàn)育種和制種的“三系配套”。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)為不育基因(S)，細(xì)胞核為不育基因(rfrf)即為不育系，植株花粉表現(xiàn)為雄性不育；當(dāng)細(xì)胞質(zhì)為可育基因(N), 細(xì)胞核為不育基因(rfrf)即為保持系，可以保證不育系跟保持系的雜交后代仍為雄性不育；當(dāng)細(xì)胞質(zhì)為不育基因(S)或可育基因(N)，細(xì)胞核為恢復(fù)基因(RfRf)時(shí)即為恢復(fù)系，能夠使不育系的育性恢復(fù)，從而生產(chǎn)出一代雜交商品種。由此可見(jiàn)，辣椒CMS不育基因型只有一種，即S(rfrf)，而可育基因型很多，但只有基因型為N(rfrf)的辣椒植株才能作為保持系。因此，選擇具有N型細(xì)胞質(zhì)的辣椒植株進(jìn)行下一步的測(cè)交等試驗(yàn)，縮小篩選群體范圍，減小工作量，提高選擇效率就顯得十分有必要。

研究表明，CMS的發(fā)生與由線粒體基因的重組而產(chǎn)生的嵌合開(kāi)放閱讀框有很大關(guān)系[2-3]，根據(jù)嵌合基因的閱讀框變化開(kāi)發(fā)了一系列與辣椒胞質(zhì)不育基因相關(guān)的分子標(biāo)記[4-9]。但這些嵌合基因發(fā)生的有無(wú)并不總是跟辣椒的育性相關(guān)聯(lián)。辣椒胞質(zhì)雄性不育的育性變化與這些嵌合基因亞化學(xué)計(jì)量拷貝數(shù)密切相關(guān)。比如，Min[10]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)高于35次時(shí)，orf456和Watp6-2也可以在一些辣椒的保持系中少量擴(kuò)增。針對(duì)這一狀況，Ji等[11]利用SRAP技術(shù)，根據(jù)辣椒不育系線粒體基因組上相比保持系和恢復(fù)系有一個(gè)10 bp的缺失開(kāi)發(fā)了SCAR130標(biāo)記，相對(duì)其他辣椒CMS標(biāo)記更加可靠和準(zhǔn)確，可以準(zhǔn)確地鑒定出辣椒細(xì)胞質(zhì)的類型。

近幾年來(lái)，由LGC公司開(kāi)發(fā)的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)新型基因分型技術(shù)，通過(guò)引物末端堿基的特異匹配來(lái)對(duì)SNP以及InDel 位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因分型。因其容易實(shí)現(xiàn)批量化、自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化，特別適用于大量群體的高通量檢測(cè)，成為國(guó)際上主流的分子標(biāo)記檢測(cè)方法之一。由于具有高度穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、低成本、高通量特點(diǎn)，KASP在水稻、小麥、大豆、花生、棉花和甘藍(lán)等作物的分子標(biāo)記輔助選擇中得到廣泛應(yīng)用[12-21]。但在辣椒作物上還沒(méi)有看到類似的報(bào)道。為了適應(yīng)后基因組時(shí)代分子標(biāo)記的高通量和快速檢測(cè)，對(duì)SCAR130進(jìn)行了KASP標(biāo)記轉(zhuǎn)化，并成功應(yīng)用于辣椒細(xì)胞質(zhì)類型的檢測(cè)，為其在辣椒三系雜交育種和制種上的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

辣椒(牛角椒)胞質(zhì)雄性不育系PC134、保持系PC135由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所茄果類蔬菜研究室經(jīng)過(guò)多代回交選育而成。不育系不育性狀穩(wěn)定，不育株率100%，保持系除了育性外其余等同于不育系。利用PC134為母本，對(duì)幾個(gè)恢復(fù)系及它們的雜交后代的細(xì)胞質(zhì)育性檢測(cè)如表1所示。其他幾種需要鑒定細(xì)胞質(zhì)育性的辣椒材料名稱及類型如表2所示。上述材料于2017年1月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)試驗(yàn)示范基地穴盤育苗?，F(xiàn)蕾前定植于聯(lián)棟塑料大棚內(nèi)，每份材料取8株，采用2X CTAB法提取其植物基因組DNA，用Nanodrop測(cè)量樣品DNA濃度，確保樣本DNA終質(zhì)量濃度為80～100 ng/μL。

1.2 KASP引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Ji等[11]提供的SCAR130標(biāo)記在辣椒CMS不育系、保持系的測(cè)序結(jié)果，針對(duì)10 bp的缺失位點(diǎn)設(shè)計(jì)KASP assay引物，由1條正向通用引物(KASP130F:5′-TTACGGCTCGTTACCGCAGC-3′)和2條反向引物組成(KASP-R1:5′-GAAGGTGACC AAGTTCATGCTCGCTTCACTTCGACGACGC-3′，下劃線部分為FAM熒光標(biāo)簽序列；KASP-R2:5′-GAAGG TCGGAGTCAACGGATTCGCTTCACTTCGACGACGCT ATTTACCAA-3′，下劃線部分為VIC熒光標(biāo)簽序列)。

1.3 KASP標(biāo)記試驗(yàn)方法

用于KASP標(biāo)記擴(kuò)增的2X Master Mix standard ROX試劑購(gòu)置于LGC公司。PCR反應(yīng)利用LGC公司的SNP檢測(cè)分析平臺(tái)完成，首先將樣本從96孔板中通過(guò)Replikator轉(zhuǎn)移至384孔板中，反應(yīng)體系4 μL，模板DNA 2 μL，Master mix 2 μL，KASP primer Mix Assay 0.07 μL。然后，將加好反應(yīng)體系的孔板進(jìn)行封膜，并低速快速離心。離心后在LC480熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s, 61 ℃退火和延伸60 s，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低0.6 ℃；94 ℃變性20 s, 55 ℃退火和延伸60 s, 26～30 個(gè)循環(huán)。

1.4 KASP標(biāo)記分析方法

將完成反應(yīng)的孔板，在酶標(biāo)儀PHERAstar讀板。檢測(cè)出的細(xì)胞質(zhì)不育(S)樣品位于圖片的右下方，為藍(lán)色標(biāo)記；細(xì)胞質(zhì)可育樣品(N)位于圖片的左上方，為綠色標(biāo)記。

表1 辣椒胞質(zhì)雄性不育系PC134、保持系PC135、恢復(fù)系PC162、PC195、41-29及其雜交后代的細(xì)胞質(zhì)育性檢測(cè)Tab.1 Detection of cytoplasm type of sterile line PC134, maintainer line PC135,restorer line PC162, PC195,41-29 and their hybridization progenies in pepper CMS

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒胞質(zhì)雄性不育系、保持系、恢復(fù)系及其F1雜交種的細(xì)胞質(zhì)育性檢測(cè)結(jié)果

利用LGC公司的SNPline檢測(cè)平臺(tái)，針對(duì)辣椒胞質(zhì)雄性不育系PC134、保持系PC135、恢復(fù)系PC162、PC195、41-29、F1雜交種及其他類型辣椒的細(xì)胞質(zhì)育性檢測(cè)結(jié)果表明，除少數(shù)幾份樣品未能檢測(cè)成功外，其余待檢測(cè)材料的細(xì)胞質(zhì)育性可以清楚地分為兩類，不育細(xì)胞質(zhì)(S)偏向X軸，而可育細(xì)胞質(zhì)(N)偏向Y軸。由表1可以看出，不育系PC134及其F1雜交后代的細(xì)胞質(zhì)育性均為不育細(xì)胞質(zhì)(S)；恢復(fù)系41-29和保持系PC135為可育細(xì)胞質(zhì)(N)，與預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果相吻合，這表明SCAR130標(biāo)記被成功地轉(zhuǎn)化為KASP130標(biāo)記?；謴?fù)系PC162的細(xì)胞質(zhì)育性發(fā)生了分離，既有不育細(xì)胞質(zhì)(S)，又有可育細(xì)胞質(zhì)(N)。在熒光定量PCR儀LC480上的檢測(cè)結(jié)果與LGC平臺(tái)的結(jié)果相同，從而證明了KASP130標(biāo)記的可靠性(圖1)。

2.2 KASP130標(biāo)記對(duì)其余類型辣椒材料的細(xì)胞質(zhì)育性檢測(cè)結(jié)果

為了檢測(cè)KASP130標(biāo)記在其余辣椒類型的適用性，利用LGC公司的SNPline檢測(cè)系統(tǒng)和平臺(tái)，對(duì)部分朝天椒、艷椒、泰辣、線椒的細(xì)胞質(zhì)育性檢測(cè)結(jié)果表明(表2)，KASP130標(biāo)記同樣表現(xiàn)可靠，展示出良好的檢測(cè)結(jié)果，除了朝天椒PC237的細(xì)胞質(zhì)育性分離外，其余材料后代的細(xì)胞質(zhì)育性均表現(xiàn)一致，表現(xiàn)為不育細(xì)胞質(zhì)(S)或可育細(xì)胞質(zhì)(N)。

A.熒光定量PCR儀LC480基因分型結(jié)果(熒光散點(diǎn)圖)；B. LGC公司SNPline平臺(tái)基因分型結(jié)果(熒光散點(diǎn)圖)。偏向X軸的藍(lán)色點(diǎn)表示所檢測(cè)樣品為FAM基因型，表示細(xì)胞質(zhì)不育(S)；偏向Y軸的綠色點(diǎn)表示所檢測(cè)樣品為VIC基因型，表示細(xì)胞質(zhì)可育(N)。A. Genotyping results (fluorescence scatter plot) in Real time PCR machine LC480; B. Genotyping results (fluorescence scatter plot) in SNPline genotyping platform of LGC. The blue spots towards the X-axis means FAM genotype, indicating sterile type cytoplasm (S); The green spots towards the Y-axis means VIC genotype, indicating fertile type cytoplasm (N).

編號(hào)Number類型Fruit type胞質(zhì)育性Cytoplasm type編號(hào)Number類型Fruit type胞質(zhì)育性Cytoplasm type編號(hào)Number類型Fruit type胞質(zhì)育性Cytoplasm typePC237-1朝天椒SPC272-1艷椒SPC367-1牛角SPC237-2朝天椒SPC272-2艷椒SPC367-2牛角SPC237-3朝天椒SPC272-3艷椒SPC367-3牛角SPC237-4朝天椒SPC272-4艷椒SPC367-4牛角SPC237-5朝天椒NPC272-5艷椒SPC367-5牛角SPC237-6朝天椒SPC272-6艷椒SPC367-6牛角SPC237-7朝天椒NPC272-7艷椒SPC367-7牛角SPC237-8朝天椒SPC272-8艷椒SPC367-8牛角S編號(hào)Number類型Fruit type胞質(zhì)育性Cytoplasm type編號(hào)Number類型Fruit type胞質(zhì)育性Cytoplasm type編號(hào)Number類型Fruit type胞質(zhì)育性Cytoplasm typePC329-1朝天椒NPC403-1泰辣NPC406-1線椒SPC329-2朝天椒NPC403-2泰辣NPC406-2線椒SPC329-3朝天椒NPC403-3泰辣NPC406-3線椒SPC329-4朝天椒NPC403-4泰辣NPC406-4線椒SPC329-5朝天椒NPC403-5泰辣NPC406-5線椒SPC329-6朝天椒NPC403-6泰辣NPC406-6線椒SPC329-7朝天椒NPC403-7泰辣NPC406-7線椒SPC329-8朝天椒NPC403-8泰辣NPC406-8線椒S

2.3 KASP130標(biāo)記在辣椒不育系及相應(yīng)保持系選育中的實(shí)際應(yīng)用

在進(jìn)一步的研究中，為了驗(yàn)證KASP130標(biāo)記在辣椒不育系及其保持系輔助選擇中的實(shí)際應(yīng)用效果，選擇了發(fā)生細(xì)胞質(zhì)育性分離的PC30朝天椒作為研究對(duì)象，利用F2分離后代中細(xì)胞質(zhì)育性為N的可育單株與細(xì)胞質(zhì)育性為S的不育單株進(jìn)行雜交，經(jīng)過(guò)幾代的回交轉(zhuǎn)育，最終轉(zhuǎn)育成功，分別獲得了幾株不育系及其對(duì)應(yīng)的保持系(表3)，進(jìn)一步說(shuō)明了KASP130標(biāo)記在不育系及其相應(yīng)保持系的分子標(biāo)記輔助選育中具有良好的效果。

3 結(jié)論與討論

辣椒胞質(zhì)雄性不育CMS作為質(zhì)核互作型雄性不育系統(tǒng)，由不育系，保持系和恢復(fù)系組成，三者缺一不可。明確地知道和鑒定出材料的細(xì)胞質(zhì)類型，在整個(gè)辣椒胞質(zhì)雄性不育三系雜交系統(tǒng)中是非常重要的一環(huán)。利用分子標(biāo)記來(lái)鑒定辣椒育種材料的細(xì)胞質(zhì)類型，可以減少工作量，更有目的地配制雜交組合，特別對(duì)保持系的選育更有意義。雖然根據(jù)辣椒胞質(zhì)雄性不育系CMS與保持系的線粒體序列的差異開(kāi)發(fā)了一系列與辣椒胞質(zhì)不育基因相關(guān)的分子標(biāo)記，如Kim等[4-5]開(kāi)發(fā)出與不育基因相關(guān)的SCAR標(biāo)記coxII和 Watp6-2，并分離和克隆了胞質(zhì)不育嵌合基因orf456[6]，隨后Gulyas等[7]在辣椒胞質(zhì)不育系線粒體coxII下游發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的嵌合基因orf507。Jo等[8]根據(jù)辣椒線粒體中來(lái)源于葉綠體的一個(gè)基因片段的缺失設(shè)計(jì)了1個(gè)新的雄性不育相關(guān)標(biāo)記 accD-U。魏兵強(qiáng)等[9]利用RAPD技術(shù)篩選得到與 CMS 不育基因連鎖的 BH19-S900 標(biāo)記，并將其轉(zhuǎn)化為共顯性的 SCAR 標(biāo)記。這些標(biāo)記為不育系的分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。但由于辣椒基因組的大量復(fù)制而存在大量重復(fù)序列和遺傳背景的不同，這些標(biāo)記并不能總是準(zhǔn)確反映辣椒的育性變化，造成在具體應(yīng)用上存在一定的局限性。Ji等[11]利用SRAP技術(shù)根據(jù)辣椒不育系線粒體基因組上相比保持系和恢復(fù)系有1個(gè)10 bp的缺失開(kāi)發(fā)的SCAR130標(biāo)記，克服了以往雄性不育分子標(biāo)記的局限性，擴(kuò)增穩(wěn)定，易于使用。

表3 細(xì)胞質(zhì)育性分離朝天椒PC30后代的保持系選育和不育系轉(zhuǎn)育Tab.3 Selection and maintainer line and transformation of sterile line towards fertility segregation progenies of pod pepper PC30

本研究針對(duì)SCAR130標(biāo)記InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用LGC公司KASP高通量SNP檢測(cè)技術(shù)，成功地把SCAR130轉(zhuǎn)化為KASP130標(biāo)記，該標(biāo)記與原來(lái)的SCAR130標(biāo)記具有同等的檢測(cè)效用，但具有KASP標(biāo)記便于批量化、自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)特點(diǎn)，特別適用于大量群體的高通量檢測(cè)，并將其成功運(yùn)用于辣椒材料不育系及其對(duì)應(yīng)保持系的分子標(biāo)記輔助選擇研究。需要指出的是，本研究并沒(méi)有像Ji等[11]研究中那樣專門分離提取辣椒的線粒體基因組，而是直接用基因組DNA作為模板，但獲得了相似的研究結(jié)果，這很可能是因?yàn)樘崛〉幕蚪MDNA已含有足夠的線粒體DNA以供完成試驗(yàn)檢測(cè)，從而進(jìn)一步證明了KASP130標(biāo)記的可靠性和準(zhǔn)確性。此外，KASP130分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果還表明，在少數(shù)幾個(gè)辣椒材料的自交后代中如牛角椒PC163和朝天椒PC237中出現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)育性分離的現(xiàn)象，既有不育細(xì)胞質(zhì)(S)，也有可育細(xì)胞質(zhì)(N)，這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因還有待進(jìn)一步研究，推測(cè)可能與辣椒胞質(zhì)雄性不育系的細(xì)胞質(zhì)來(lái)源不同有關(guān)。

為了適應(yīng)后基因組時(shí)代分子標(biāo)記的高通量和快速檢測(cè)，本研究把細(xì)胞質(zhì)育性標(biāo)記SCAR130成功地轉(zhuǎn)化為KASP130分子標(biāo)記，并成功應(yīng)用于辣椒細(xì)胞質(zhì)類型的檢測(cè)，為其在辣椒三系雜交育種和制種上的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定了基礎(chǔ),也為今后類似分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記提供了思路借鑒和參考。

致謝：感謝河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所花生研究室的鄭錚博士在KASP基因分型中提供的技術(shù)指導(dǎo)和幫助。