小檗堿對血管性認知功能障礙模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

王汝歡， 周 茹， 丁 洋， 周振興

(1. 深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司， 廣東 深圳 518102； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 檢驗科， 北京 100015；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 消化中心， 北京 100010； 4. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科， 北京 100010)

伴隨人們生活水平的提高，心腦血管疾病發(fā)病率逐年提高，由疾病伴隨的慢性腦缺血誘發(fā)血管性認知功能障礙嚴重威脅患者生活質(zhì)量[1]。各種血管性因素(腦內(nèi)血管低灌流、缺血、缺氧)導(dǎo)致不同比例或不同程度局灶性與彌漫性病變的白質(zhì)損害為主的組織病理學(xué)特點；臨床表現(xiàn)出各種不同性質(zhì)和類型的感覺與運動障礙以及執(zhí)行功能障礙，記憶和語言功能障礙相對較輕，人格保持完整，突出表現(xiàn)皮層下功能障礙?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認為，早期干預(yù)慢性腦缺血的病理生理過程，可以延緩血管性認知功能障礙的進程，明顯改善患者生存質(zhì)量，甚至避免血管性癡呆的發(fā)生。祖國中醫(yī)藥發(fā)展迅速，中藥對血管性認知功能障礙具有多途徑、多靶點的整體性治療作用優(yōu)勢，受到醫(yī)學(xué)研究者的重視[2]。氧化應(yīng)激損傷是缺氧后血管性認知功能障礙發(fā)生主要的發(fā)病機制[3]。小檗堿亦稱黃連素，是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿，本研究采用結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈建立血管性認知功能障礙模型，研究小檗堿對氧化應(yīng)激損傷的治療作用，同時觀察了海馬中炎性因子的變化以及皮層中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化，了解小檗堿治療血管性認知功能障礙的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑

鹽酸小檗堿購自廣州威佳科技有限公司，純度：99%，批號：160810；5-羥色胺(5-HT)標準品購自中國生物藥品制品檢定所，批號：121656-201405；單胺氧化酶(MAO)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽(GSH)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒，均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20170623、20170520、20170220、20170412；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測試盒和白介素-1β(IL-1β)測試盒，購自優(yōu)而生公司，批號分別為L161123029、L160818450。

1.2 動物模型制備[4-5]

Wistar大鼠SPF級，健康雄性，68只，體重180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證編號為SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)條件：溫度(24±1)℃，相對濕度(50±10)%，明暗周期12 h，自由飲水、攝食。隨機分為正常組10只、假手術(shù)組10只、造模組48只。造模組腹腔注射2%戊巴比妥鈉3 ml/kg麻醉后，仰臥位固定在大鼠固定板上，頸部用理發(fā)器去除毛發(fā)，用酒精和碘酒依次消毒，頸部正中用剪刀剪開皮膚，向兩側(cè)分開頜下腺，用眼科鑷子鈍性分離兩側(cè)頸總動脈，放置手術(shù)線永久結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈后，縫合皮膚，消毒后放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅分離兩側(cè)頸總動脈不結(jié)扎。大鼠在造模過程中出現(xiàn)死亡或活動異常影響實驗者予以剔除并進行隨機補充，以保證每組實驗動物數(shù)，其中，5只死于麻醉過量，2只死于手術(shù)時血管破裂出血過多，1只手術(shù)后出現(xiàn)肢體活動障礙予以剔除。造模組又隨機分為血管性認知功能障礙模型組和小檗堿低、中、高劑量治療組，每組10只。正常組、假手術(shù)組和模型組腹腔注射5 ml/kg生理鹽水，小檗堿低、中、高劑量治療組腹腔注射小檗堿20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg，5 mL/kg，每天1次，共34 d。大鼠認知功能采用Morris水迷宮實驗進行評價[6]。將假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期作為參考值，如果模型組大鼠逃避潛伏期與參考值之差與參考值的比值>20%，則可判斷模型成功[7]。實驗中，模型組和小檗堿各治療組大鼠均有缺失，模型組死亡2只，小檗堿各治療組各死亡1只，死亡時間均在開始腹腔給予小檗堿或生理鹽水后1周內(nèi)。

1.3 Morris水迷宮實驗[8-9]

將Morri水迷宮直徑1.5 m、高0.6 m、水深設(shè)定為0.4 m，將水迷宮平分為4個象限，依次標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，頂部有圖像采集系統(tǒng)并于計算機相連。將平臺放置在Ⅳ象限，平臺低于水面2 cm。用空調(diào)控制室溫25℃，水溫控制在(25±1)℃。第一階段定位航行實驗(place navigation test, PNT)：共5 d。第29日，將平臺去除進行適應(yīng)性游泳，每次2 min，上、下午各1次。第30～33日，將大鼠分別依次從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限面朝池壁放入水中，計時60 s，若大鼠在放入后60 s內(nèi)找到并爬上平臺，則讓大鼠在平臺上停留10 s后，放回大鼠籠中休息；若大鼠在放入后60 s內(nèi)沒有平臺，則將其放在平臺上停留15 s后，放回大鼠籠中休息。每天2次，上、下午各1次，共4 d。實驗?zāi)康氖窃u價大鼠的空間獲得能力即學(xué)習(xí)能力，統(tǒng)計大鼠逃避潛伏期(escape latency，EL)，即從大鼠放入水中開始計時至大鼠爬上平臺所經(jīng)歷的時間，未找到平臺的大鼠逃避潛伏期以60 s統(tǒng)計。第二階段空間探索實驗(spatial probe test, SPT)：去除平臺，將大鼠從Ⅱ象限面朝池壁放入水中，計時120 s。實驗?zāi)康氖窃u價大鼠保持經(jīng)驗的能力即記憶能力，統(tǒng)計大鼠從入水120 s內(nèi)大鼠通過Ⅳ象限內(nèi)平臺所在位置的次數(shù)。給藥28 d后進行第一階段定位航行實驗5 d，結(jié)束后第34日進行第二階段空間探索實驗，開展兩實驗期間大鼠正常給藥。

1.4 指標檢測

Morris水迷宮實驗結(jié)束后，大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，用剪刀斷頭，剪開皮膚后用剪刀順著骨縫剪開腦殼，用彎鑷取出大腦，放在冰盤上加冷藏的生理鹽水，用手術(shù)刀片切取前腦皮層組織，然后分離海馬組織。制備10%皮層組織高氯酸勻漿液，離心后采用高效液相色譜儀測定上清液中5-HT含量。按皮層濕重1∶10(mg：μl)預(yù)冷的生理鹽水制備10%皮層勻漿液，實驗在冰浴中進行，離心后取上清液，采用MAO檢測試劑盒檢測組織中MAO活性。按海馬濕重1∶10(mg：μl)預(yù)冷的生理鹽水制備10%海馬勻漿液，實驗在冰浴中進行，離心后取上清液，保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA法檢測海馬組織中SOD活性以及MDA、GSH、TNF-α、IL-1β的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對大鼠逃避潛伏期和穿過平臺次數(shù)的影響

模型組較假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.01)，通過平臺次數(shù)顯著減少(P<0.01)；小檗堿各治療組較模型組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01，P<0.05)，通過平臺次數(shù)明顯增加(P<0.01，P<0.05，表1)。小檗堿高劑量組第3、4日降低逃避潛伏期作用優(yōu)于低劑量組，與中劑量組相當；小檗堿低、中、高劑量組之間通過平臺次數(shù)沒有明顯差異。

Tab. 1 Effects of berberine on the escape latency and the times of passing through the platform of VCI model

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham-operated group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;

▲P<0.05vsberberine 20 mg/kg group

2.2 小檗堿對大鼠海馬SOD活性和GSH、MDA含量的影響

模型組較假手術(shù)組大鼠海馬SOD、GSH顯著降低(P<0.01)，MDA顯著升高(P<0.01)；小檗堿各治療組較模型組大鼠SOD、GSH顯著升高(P< 0.01)，MDA顯著降低(P<0.01，表2)。小檗堿高劑量組升高SOD的作用優(yōu)于低劑量組，與中劑量組相當；小檗堿中、高劑量組升高GSH、降低MDA的作用相當，均優(yōu)于低劑量組。

Tab. 2 Effects of berberine on the levels of SOD activity, GSH and MDA in the hippocampus of VCI model

SOD: Superoxide dismutase; GSH: Glutathione; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham-operated group;△P<0.05,△△P<0.01vsModel group;

▲P<0.05,▲▲P<0.01vsberberine 20 mg/kg group

2.3 小檗堿對大鼠海馬TNF-α、IL-1β的影響

模型組較假手術(shù)組大鼠海馬TNF-α、IL-1β明顯升高(P<0.01)；小檗堿各治療組較模型組大鼠TNF-α、IL-1β明顯降低(P<0.01，表3)。小檗堿高劑量組降低TNF-α的作用優(yōu)于低、中劑量組；小檗堿高劑量組降低IL-1β的作用優(yōu)于低劑量組，與中劑量組相當。

GroupnTNF-α IL-1β Normal10113.1±13.62.1±0.2Sham-operated10109.7±14.52.1±0.2Model8266.5±15.9??##6.9±0.9??##Berberine 20 mg/kg9217.6±13.5??##△△5.0±0.8??##△△Berberine 40 mg/kg9216.4±10.8??##△△4.7±0.6??##△△Berberine 60 mg/kg9202.3±9.5??##△△▲▲○○4.2±0.7??##△△▲

TNF-α: Tumor necrosis factor alpha; IL-1β: Interleukin-1 beta

*P<0.05,**P<0.01vsNormal group;#P<0.05,##P<0.01vsSham-operated group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsberberine 20 mg/kg group;○○P<0.01vsberberine 40 mg/kg group

2.4 小檗堿對前腦皮層5-HT含量和MAO活性的影響

模型組較假手術(shù)組大鼠前腦皮層5-HT含量明顯降低(P<0.01)，MAO活性明顯升高(P<0.01)；小檗堿各治療組較模型組大鼠5-HT含量明顯升高(P<0.01)，MAO活性明顯降低；小檗堿60 mg/kg 5-HT含量(P<0.01，表4)。小檗堿高劑量組升高5-HT含量的作用優(yōu)于低、中劑量組；小檗堿中、高劑量組降低MAO活性的作用優(yōu)于低劑量組，兩組的作用相當。

Groupn5-HT (ng/g)MAO(U/mg)Normal10434.1±25.420.8±2.3Sham-operated10428.0±23.421.1±2.1Model8219.3±18.4??##40.3±4.0??##Berberine 20 mg/kg9385.4±23.4??##△△30.3±4.5??##△△Berberine 40 mg/kg9403.7±14.6??#△△26.2±3.6??##△△▲Berberine 60 mg/kg9422.6±16.9△△▲▲○23.5±1.9?#△△▲▲

5-HT: 5-hydroxytryptamine; MAO: Monoamine oxidase

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P< 0.01vssham-operated group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsberberine 20 mg/kg group;

○P<0.05vsberberine 40 mg/kg group

3 討論

高血壓、高血脂、糖尿病等多種疾病可誘發(fā)血管性認知功能障礙，腦血流量的變化可能是其主要原因。血管性認知功能障礙主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶功能的降低。研究表明，血管性認知功能障礙可能與氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂等多重因素誘發(fā)神經(jīng)元、白質(zhì)的損害有關(guān)。大鼠實驗雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎能夠較好地模擬臨床疾病腦血流障礙的臨床癥狀[10]，本研究采用此大鼠模型，評價模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，并分析相應(yīng)的發(fā)病機制。

小檗堿能夠通過血腦屏障，在腦組織起到治療作用，為血管性癡呆的治療提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。小檗堿具有擴張缺血區(qū)微循環(huán)血管，改善缺血區(qū)血液供應(yīng)的作用。從表1可見，本研究采用結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈的方法成功制作血管性認知功能障礙模型大鼠，經(jīng)小檗堿各劑量組治療4周后，大鼠的認知功能均得到顯著改善，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性的作用趨勢。

在神經(jīng)元缺血性損傷中，氧化應(yīng)激損害起到主要作用。研究證實血管性認知功能障礙大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細胞線粒體氧化應(yīng)激水平明顯升高[11]。超氧化物歧化酶SOD屬于一種金屬酶，廣泛存在于生物體內(nèi)，可以歧化超氧離子，保護細胞不受機體內(nèi)、外環(huán)境中超氧離子損傷的作用[12]。GSH可以直接與氧自由基結(jié)合，起到抗氧化的作用。丙二醛MDA，是一種醛類物質(zhì)，是自由基脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，對細胞具有嚴重的損害作用，能夠間接地反映機體的自由基代謝狀況，是判斷脂質(zhì)過氧化程度的一個重要指標[13]。小檗堿是一種天然的生物堿，具有抗炎、抗菌、抗氧化作用[14-16]。從表 2可見，小檗堿具有明顯的抗氧化作用，在神經(jīng)元缺血保護中起重要作用。

實驗證明，TNF-α和IL-1β等炎癥因子與學(xué)習(xí)記憶功能損傷密切相關(guān)[17-18]。腦缺血引起氧自由基損傷，激活腦組織內(nèi)皮細胞和膠質(zhì)細胞釋放炎性因子，誘發(fā)嗜中性粒細胞遷移到腦實質(zhì)，加重腦損傷，增強氧自由基的損傷作用，形成惡性循環(huán)，進一步加重缺血對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[19]。從表 3可見，小檗堿通過直接地抗氧化應(yīng)激作用和阻斷炎癥通路相關(guān)炎性因子的釋放，雙重阻斷這種惡性循環(huán)，減少腦組織損傷。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在其過程中起到易化作用[20]。五羥色胺是非常重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，其再攝取抑制劑能有效改善動物在Morris水迷宮中認知功能。從表 4可見，認知功能障礙模型組大鼠皮質(zhì)中五羥色胺的含量明顯下降，單胺氧化酶活性明顯升高，而小檗堿治療4 周可明顯提高皮層五羥色胺的含量、降低單胺氧化酶的活性，改善單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。

綜上所述，小檗堿能夠改善血管性認知功能障礙模型大鼠認知功能，具有減輕氧化應(yīng)激損傷、減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的作用。