2-12烷基-6-甲氧基環(huán)己基-2,5-二烯-1,4-二酮(DMDD)抗彌漫大B淋巴瘤的作用及機(jī)制*

洪 凱, 蔣盼若, 柯瑞君， 應(yīng)佳豪, 張肖艷, 陳佳玉

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 紹興 312000)

B淋巴瘤是起源于B細(xì)胞的腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤兩大類，其中彌漫性大B淋巴瘤(diffuse large B lymphoma，DLBCL)為非霍奇金淋巴瘤最常見的一個(gè)類型，其發(fā)病率占非霍奇金淋巴瘤的30 %～35 %[1]。DLBCL具有侵襲性和中高度惡性的特點(diǎn)，對患者的生命和健康危害極大。目前，利妥昔單抗加環(huán)磷酰胺、長春新堿、多柔比星和潑尼松(R-CHOP)作為DLBCL化療的標(biāo)準(zhǔn)方案，盡管該方案可以延長患者的生存期，提高患者響應(yīng)率(RR)，但仍有超過30 % DLBCL患者對該方案治療不敏感或者出現(xiàn)了抗藥性[2]。因此我們需要開發(fā)更加有效，且毒性作用小的新藥，以實(shí)現(xiàn)對DLBCL真正意義上的臨床治療。楊桃為廣泛分布于東南亞的水果之一，其根作為治療慢性陣發(fā)性頭痛和關(guān)節(jié)痛的良藥已有數(shù)千年的歷史。DMDD為來源于楊桃根的苯醌類化合物，具有降血糖、抗脂質(zhì)過氧化、誘導(dǎo)人乳腺癌凋亡、抑制肺癌和骨癌細(xì)胞擴(kuò)散的作用[3]。但有關(guān)該藥物是否具有抗DLBCL的作用一直未見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將楊桃根中苯醌類化合物2-Dodecyl-6-Methoxycyclohexa-2, 5-Diene-1, 4-Dione(DMDD)作用于DLBCL細(xì)胞OCI-LY19，探討該藥對OCI-LY19細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并分析其作用的相關(guān)機(jī)制，以期為臨床治療DLBCL的新藥發(fā)現(xiàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DLBCL細(xì)胞株OCI-LY19購自于南京科佰生物科技有限公司；4周齡雄性BALB/C小鼠購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMDD源于上海摩貝生物科技有限公司；PCR引物由上海Sangon Biotech公司合成；一抗和酶標(biāo)二抗源于武漢BOSTER Biotech公司；AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒、PI單染試劑盒和脫脂奶粉為美國BD公司產(chǎn)品；Cell titer 96? AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay試劑盒來源于美國Promega公司；LDH試劑盒為上海Roche Applied Science公司產(chǎn)品；JC-1染色試劑盒由碧云天提供；胰酶、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清均于美國Gibco公司購買。ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國SIGMA公司；SuperScript?III First-Strand Synthesis System和TRIzol源于美國Invitrogen公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒、hoechst 33342和RIPA裂解液購自于上海Beyotime公司。

1.2 小鼠的抑瘤實(shí)驗(yàn)

取4周齡雄性BALB/C鼠100只，分為5組，每組20只，無菌條件下飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。取對數(shù)生長期的OCI-LY19細(xì)胞，600 g離心5 min，去上清，PBS清洗2次，每次600 g離心5 min棄上清，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至1 × 107cells/ml，腹股溝注射BALB/C小鼠，0.1 ml/只，于腫瘤細(xì)胞接種的2 d后分別灌胃0、1、5、25、125 mg/kg劑量的DMDD，1次/2天，于首次給藥后的第18日每組殺10只小鼠，其余小鼠仍舊正常飼養(yǎng)，記錄其生存期。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)增長期OCI-LY19細(xì)胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋成1×105cells/ml，加入96孔平底培養(yǎng)板，每孔100 μl，在37℃、5 % CO2和飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)24 h。離心棄上清(600 g/min，離心5 min)，分別加入100 μl含有DMDD的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，使藥物終濃度分別為0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L和125 μmol/L，設(shè)三復(fù)孔。將細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5% CO2和飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、24、48和72 h時(shí)，取出細(xì)胞，于細(xì)胞上清液中加入Cell Titer 96?AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay試劑，20 μl /孔。37℃ 5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 h，利用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光度值(OD值)，繪制細(xì)胞生長曲線，分析藥物作用后細(xì)胞的增殖情況。

根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0 μmol/L、5 μmol/L和25 μmol/L的DMDD作為后續(xù)用藥濃度作用OCI-LY19細(xì)胞24 h，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、hoechst 33342染色分析細(xì)胞核型變化、JC-1染色觀察細(xì)胞線粒體膜電位的改變、LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測藥物細(xì)胞毒作用、qPCR和Western blot分析細(xì)胞內(nèi)各基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的改變，分析藥物作用的分子機(jī)制。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測OCI-LY19細(xì)胞凋亡率

取經(jīng)過DMDD處理、培養(yǎng)24 h的OCI-LY19細(xì)胞，按美國BD公司的FITC和PI雙染試劑盒的說明書進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.5 Hoechst 33342染色分析OCI-LY19細(xì)胞核型變化

取經(jīng)過DMDD處理、培養(yǎng)24 h的OCI-LY19細(xì)胞，PBS清洗3次，每次經(jīng)600 g離心5 min回收細(xì)胞，于細(xì)胞沉淀中加入含有10 ng/ml hoechst 33342染液的PBS液1 ml，避光、室溫染色15 min，經(jīng)600 g離心5 min，棄上清，PBS清洗3次后(每次經(jīng)600 g離心5 min回收細(xì)胞)，將細(xì)胞置于載玻片上，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的核型變化。

1.6 JC-1染色觀察OCI-LY19細(xì)胞線粒體膜電位的改變

取經(jīng)過DMDD處理、培養(yǎng)24 h的OCI-LY19細(xì)胞，于各孔中分別加入0.5 ml JC-1工作液，37℃ 5% CO2避光孵育30 min，600 g離心5 min，棄上清，PBS清洗3次，每次均經(jīng)600 g 離心5 min后棄上清。用0.5 ml RPMI-1640完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，靜止5 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析DMDD作用后OCI-LY19細(xì)胞線粒體膜電位的改變。

1.7 LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測DMDD對OCI-LY19細(xì)胞毒性作用

取經(jīng)過DMDD處理、培養(yǎng)24 h的OCI-LY19細(xì)胞，600 g離心5 min，分離細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照LDH檢測試劑盒說明書分別檢測細(xì)胞裂解液內(nèi)和培養(yǎng)上清中LDH的濃度，并通過公式LDH釋放率(%)=培養(yǎng)液中LDH含量 /(培養(yǎng)液中LDH含量+細(xì)胞裂解液中LDH含量)×100%計(jì)算LDH的釋放率，分析DMDD對OCI-LY19細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

1.8 QPCR檢測OCI-LY19細(xì)胞基因mRNA水平

取經(jīng)過DMDD處理、培養(yǎng)24 h的OCI-LY19細(xì)胞，600 g離心5 min，棄上清，PBS清洗3次，每次經(jīng)600 g離心5 min回收細(xì)胞，利用Trizol提取細(xì)胞RNA，并經(jīng)Nano Drop定量后用SuperScript? III First-Strand Synthesis System逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，試劑用量和操作均按說明書進(jìn)行。以β-actin為內(nèi)參，qPCR法檢測caspase-3、bax、bcl-2、jak 1、jak 2、stat 3和iκBα基因mRNA的CT值，通過2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探討DMDD作用后OCI-LY19細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。

1.9 Western blot檢測OCI-LY19細(xì)胞蛋白水平

取經(jīng)過DMDD處理、培養(yǎng)24 h的OCI-LY19細(xì)胞， 600 g離心5 min，回收細(xì)胞，PBS清洗3次，每次均經(jīng)600 g離心5 min回收細(xì)胞。于細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液(1×107cells/ml)，冰上裂解10 s， 12 000 g離心20 min。取上清1 μl進(jìn)行BCA定量，其余按比例加入上樣緩沖液，95℃煮沸5 min，待冷卻后離心。按30 μg / 孔上樣，以β -actin為內(nèi)參進(jìn)行蛋白電泳。其后，蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)、封閉和一抗、酶標(biāo)二抗孵育和ECL顯色后，利用Image Quant LAS 4000 mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行圖像采集，第一抗體和酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)均采用試劑說明書建議的稀釋倍數(shù)的均值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DMDD對 小鼠的抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

0-125 mg/kg DMDD灌胃荷瘤小鼠，1次/2天，首次給藥的第18日取瘤組織稱重，結(jié)果如表1，與0 mg/kg DMDD治療組相比較，DMDD可抑制OCI-LY19瘤組織的生長，且其抑制作用與該藥作用的劑量有關(guān)，當(dāng)DMDD用藥劑量≥1 mg/kg時(shí)，其治療效果尤其顯著(P<0.01)。此外，表1結(jié)果證實(shí)，0～25 mg /kg DMDD治療組荷瘤小鼠的生存期顯著延長(P<0.01)，當(dāng)用藥劑量達(dá)到125 μg /kg時(shí)，小鼠生存期雖較未用藥組有所延長，但較5 mg/kg和25 mg/kg治療組縮短。

DMDD dosageTumor tissues weight (g)Survival time (d)0 mg/kg 2.23±0.1024.0±0.11 mg/kg 2.04±0.0941.0±0.15 mg/kg 1.12±0.07??67.0±0.1??25 mg/kg 0.65±0.05??117.0±0.1??125 mg/kg 0.38±0.13??52.0±0.2??

**P<0.01vs0 mg/kg DMDD treated group

2.2 DMDD對OCI-LY19細(xì)胞增殖活性的影響

如圖1所示，DMDD作用后，OCI-LY19細(xì)胞的增殖活性明顯受抑制(P<0.01)，且抑制程度與藥物作用的濃度和時(shí)間有關(guān)。

Fig.1The proliferation activity results of OCI -LY19 cells (n=3)

**P<0.01vs0 μmol/L DMDD group

2.3 DMDD對OCI-LY19細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示(圖2)，OCI-LY19細(xì)胞經(jīng)5 μmol/L或25 μmol/L DMDD作用24 h后，細(xì)胞凋亡水平分別為21.40%±0.06%和55.30%± 0.09%，較未用藥的對照組(0.20%±0.02%)顯著增加(P<0.01)，且其作用效果與用藥劑量相關(guān)。

Fig.2The apoptosis of OCI -LY19 cells detected by flow cytometry (n=3)

2.4 DMDD對OCI-LY19細(xì)胞核變化的影響

結(jié)果如圖3所示，OCI-LY19細(xì)胞經(jīng)5 μmol/L或25 μmol/L DMDD作用24 h后，細(xì)胞核出現(xiàn)凝集、碎裂的現(xiàn)象，且出現(xiàn)了凋亡小體。細(xì)胞發(fā)生核型改變的比率與藥物作用的劑量有關(guān)。

Fig.3The results of Hoechst 33342 staining (n=3)

2.5 DMDD對OCI-LY19細(xì)胞線粒體膜電位的影響

結(jié)果如圖4所示，OCI-LY19細(xì)胞分別經(jīng)0、5或25 μmol/L DMDD作用24 h后，細(xì)胞線粒體膜電位顯著下調(diào)，且其下調(diào)水平與藥物作用的劑量有關(guān)。

Fig.4JC -1 staining results of cell mitochondrial membrane potential (n=3)

2.6 DMDD對OCI-LY19細(xì)胞LDH釋放率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，隨著DMDD作用濃度的增高，培養(yǎng)液中LDH釋放的水平也較對照組顯著增加(P<0.01)，細(xì)胞損傷情況與DMDD的用藥濃度有關(guān)。

Tab.2The results of LDH release experiment (n=3)

DMDD dosageMedium LDH (%)0 μmol/L1.45±0.02 5 μmol/L18.37±0.03??25 μmol/L27.44±0.05??

**P<0.01vs0 μmol/L DMDD treated group

2.7 DMDD對OCI-LY19細(xì)胞基因mRNA水平的影響

QPCR檢測結(jié)果顯示(表3)，25 μmol/L DMDD作用OCI-LY19細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)caspase-3和bax基因mRNA水平較對照組明顯上調(diào)，而基因bcl-2、bcl-xl、jak 1、jak 2、stat 3和iκBα轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降(P<0.01)。

2.8 DMDD對OCI-LY19細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響

OCI-LY19細(xì)胞經(jīng)0 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L DMDD作用24 h后，p-IκBα、Caspase-3和BAX的水平較0 μmol/L DMDD作用組顯著增加，而BCL-2、JAK2和STAT3等的水平明顯下調(diào)(P< 0.01，圖5，表4)。

Fig.5The Western blot results of the proteins from OCI-LY19 cells after treated with 0 μmol/L, 5 μmol/L or 25 μmol/L DMDD for 24 h

Tab. 3 The real time PCR results (n=3)

**P<0.01vs0 μmol/L DMDD treated group

Tab. 4 The Western blot results of the proteins from OCI-LY19 cells (n=3)

**P<0.01vs0 μmol/L DMDD treated group

3 討論

細(xì)胞凋亡是由一系列基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡方式，B細(xì)胞凋亡障礙是因?yàn)锽細(xì)胞中某些細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，從而B細(xì)胞會(huì)無限增殖，最終導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生[4]。因此，如能發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)DLBCL凋亡障礙的新藥，則必將有助于DLBCL的臨床治療。

本研究將不同濃度的DMDD作用于DLBCL細(xì)胞株OCI-LY19和接種有OCI-LY19細(xì)胞的BALB/C裸鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DMDD可顯著抑制OCI-LY19細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)其凋亡，下調(diào)細(xì)胞線粒體膜電位，發(fā)揮明顯的細(xì)胞毒作用。同時(shí)該藥能夠抑制荷瘤小鼠DLBCL組織的生長、延長了荷瘤小鼠的生存期。QPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，DMDD明顯上調(diào)了OCI-LY19細(xì)胞內(nèi)caspase-3和bax基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平和IκBα的磷酸化，抑制了bcl-2、bcl-xL、jak2和stat3基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

JAK2和STAT3蛋白為JAK / STAT信號通路的主要成員，JAK2基因的表達(dá)受抑，則將直接抑制了STAT3的表達(dá)及其磷酸化[5]，從而減少了轉(zhuǎn)位到核的p-STAT3與IRF9的復(fù)合物，并進(jìn)一步影響了作為凋亡調(diào)控關(guān)鍵因素的BAX與BCL-2(或BCL-xL)的構(gòu)成比例。資料顯示，當(dāng)BAX與BCL-2(或BCL-xL)形成同源二聚體時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而形成異源二聚體時(shí)則細(xì)胞凋亡受抑制[6]，因此BCL-2 / BAX(BCL-xL / BAX)也被稱為啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[7,8]。本實(shí)驗(yàn)中，DMDD通過抑制JAK 2 / STAT 3信號通路而打破了OCI-LY19細(xì)胞原有的BAX和BCL-2(或BCL-xL)間的平衡，BAX表達(dá)上調(diào)，而BCL-2和BCL-xL的表達(dá)顯著受抑，促使細(xì)胞朝形成BAX同源二聚體發(fā)展，線粒體內(nèi)凋亡因子釋放，線粒體通透性改變、膜電位下降，細(xì)胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶Caspase-3活化[9]，進(jìn)而引起細(xì)胞廣泛的損傷和變性[10]，最終導(dǎo)致OCI-LY19細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。

此外，NF-κB通路中的關(guān)鍵蛋白NF-κB和IκBα與DLBCL細(xì)胞的增殖和凋亡緊密相關(guān)[12]。IκBα為IκBs的主要成員，有研究表明它在調(diào)控NF-κB激活的經(jīng)典途徑中扮演著重要角色[13，14]，當(dāng)細(xì)胞未受到刺激時(shí)，大部分的NF-κB二聚體通過與細(xì)胞質(zhì)中抑制因子IκBα等結(jié)合而以無活性的狀態(tài)存在。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)DLBCL細(xì)胞OCI-LY19經(jīng)DMDD作用后，細(xì)胞內(nèi)p-IκBα水平增加，從而抑制了NF-κB的活化，并進(jìn)一步減弱了NF-κB對BCL-2基因表達(dá)的刺激作用[15]，致使BCL-2 / BAX的比例發(fā)生改變[16]，最終在與JAK 2 / STAT 3信號通路蛋白共同作用下，加速了OCI-LY19細(xì)胞的凋亡。

總之，DMDD可以抑制荷瘤小鼠瘤組織的生長，延長其生存期，并通過影響OCI-LY19細(xì)胞JAK2 / STAT3和NF-κB信號通路，下調(diào)BCL-2 / BAX、活化Caspase-3，進(jìn)而激活OCI-LY19細(xì)胞線粒體凋亡的內(nèi)源性通路，從而發(fā)揮其抗DLBCL的作用。該研究為探討DMDD在DLBCL臨床治療中的進(jìn)一步應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。