新型微血管儀在妊娠大鼠動脈功能下調(diào)機制研究中的應用

林 晨 王銘偉 張再重 林 楠 楊為錦 吳偉航 王 瑜

以妊娠高血壓綜合征為代表的妊娠期疾病是導致孕產(chǎn)婦和圍生期胎兒死亡的主要原因之一，血管功能下調(diào)在其中扮演重要角色，臨近子宮的微小動脈功能改變尤具研究價值[1～3]。目前測量微小動脈舒縮功能的主流方法是用細金屬絲掛鉤勾住血管環(huán)，并通過張力轉(zhuǎn)換器將金屬絲傳導的牽張力進行換算來表達血管環(huán)舒縮變化[3～5]。然而受限于金屬絲的口徑以及硬度，現(xiàn)有方法對微小動脈舒張與收縮功能的測量僅僅局限于口徑大于300μm的微小血管，當靶血管的口徑小于300μm，用現(xiàn)有的技術手段很難測量。在本研究中，筆者采用自主研發(fā)的新型雙針套接式微小動脈舒縮功能測試儀對大鼠微小動脈舒縮功能進行測量，成功測得口徑小于300μm的大鼠子宮動脈功能，為妊高癥血管功能改變的機制研究提供了更多實驗依據(jù)。

材料與方法

1.材料:(1)雙針套接式微血管功能測量裝置：由恒溫浴槽、可伸縮軟針、固定軟針、恒溫浴槽進水口、出水口等五部分構(gòu)成。裝置主體為樹脂材料，采用3D打印而成，長8cm，寬5cm，高2cm，恒溫浴槽長5cm，寬3cm，高2cm，出水口直徑0.3cm，固定軟針以及可伸縮軟針為pet高分子材料制成，主體長度4cm，主體外徑0.15cm，尖端長度0.5cm，尖端直徑200μm；軟針外接輸液管道和夾閉器，可經(jīng)由軟針向血管腔內(nèi)輸注液體，夾閉器夾閉后可使血管腔形成閉合腔，其內(nèi)液體不與外接相交通。(2)實驗動物：清潔級12周齡雌性未孕以及妊娠的Sprague-Dawley(SD)大鼠，健康，體質(zhì)量200±20g，由福州總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供。傳統(tǒng)610 M 型多通道血管張力測定儀(含2根直徑80μm的不銹鋼絲掛鉤，丹麥DMT 公司)，恒溫浴槽購自寧波江南儀器廠，JH-280425張力換能器由福建醫(yī)科大學生理實驗室提供。其他組件包括倒置顯微鏡、攝像機、監(jiān)視器、示波器記錄儀、光源，均由尼康公司提供。試劑氯化鉀(potassium chloride，KCl)、去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)、 乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)由廈門鹿茸公司提供。

2.動物分組及實驗設計：實驗動物分A、B兩組，A組為12周齡雌性未孕SD大鼠， B組為12周齡雌性妊娠大鼠，妊娠時間18天，每組大鼠8～10只。兩組大鼠的腹主動脈舒縮功能采用新型雙針套接式測量儀和傳統(tǒng)金屬絲掛鉤式測量儀分別測量，明確對于同組大鼠的腹主動脈舒縮功能，采用新型測試儀與傳統(tǒng)儀器是否有差異；同時將采用相同測量儀器檢測的不同組的大鼠腹主動脈舒縮功能做比較，明確不同組的大鼠腹主動脈的舒縮功能是否發(fā)生變化，如果有差異，兩種儀器測得的差異趨勢是否一致。兩組大鼠的子宮動脈無法采用傳統(tǒng)測量儀測量，僅采用新型微動脈測試儀測量，明確不同組大鼠子宮動脈的舒縮功能是否發(fā)生變化，如果存在差異，這種差異與兩組大鼠腹主動脈功能的差異趨勢是否一致。

3.大鼠離體動脈血管環(huán)制備以及裝置的連接：大鼠處死，取腎動脈開口水平至髂動脈分叉處之間的腹主動脈管段，長度約3mm，同時取大鼠自子宮中央?yún)^(qū)向外側(cè)第2個胚胎所屬的子宮動脈的血管段[6]，長度約3mm，血管段浸入4℃的Kreb液保存?zhèn)溆谩２捎眯滦蛢x器測量時，將制備好的離體動脈段浸泡于儀器的37℃恒溫水浴槽內(nèi)，置于顯微鏡的視野中心，血管段一端首先用精細顯微外科鑷套接在固定軟針尖端上，用10-0眼科尼龍單絲將其固定，從固定軟針向血管腔內(nèi)緩慢注入Kreb液，直至將血管腔中的血液以及雜質(zhì)完全去除，血管段另一端朝向可伸縮軟針尖端，將可伸縮軟針推向血管段的游離端，直至可伸縮軟針尖端也套入血管段，用10-0眼科尼龍單絲固定此端。將連接可伸縮軟針的輸液管外接到輸液袋上，袋中靜水壓保持在90mmHg。

4.檢測步驟：動脈收縮功能檢測：采用51mmol/L氯化鉀溶液(51mmol/L KCl)刺激動脈段/環(huán)2min，繪制時間-收縮百分比曲線；動脈舒張功能檢測：采用3×10-7mol/L的NE預收縮5min，待血管的收縮達到平臺值并趨于穩(wěn)定后依次加入濃度梯度為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的ACh溶液，繪制劑量-舒張曲線[7,8]。每只大鼠的腹主動脈段均取兩份，一份采用傳統(tǒng)儀器測量，一份采用新型儀器測量，比較兩種方法測得的動脈舒張、收縮功能曲線。大鼠的子宮動脈僅采用新型儀器測量。

5.組織學檢測：將測量后的血管段/環(huán)制成石蠟切片，蘇木素-伊紅(haematoxylin-eosin, HE)染色后，在光學顯微鏡下觀察血管壁的完整性以及血管內(nèi)膜情況。

6.血管舒縮程度計算公式:血管收縮百分比= [(靜息直徑 - 收縮直徑)/靜息直徑]×100%；血管舒張百分比=[(舒張直徑-NE預收縮直徑)/(靜止直徑 - NE預收縮直徑)]×100%[6,7]。

結(jié) 果

1.腹主動脈舒張功能檢測結(jié)果：采用傳統(tǒng)方法導出的A組大鼠與B組大鼠腹主動脈的ACh舒張百分比曲線差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B組的腹主動脈對于ACh的舒張反應小于A組(圖1A)。采用新型儀器導出的A組與B組大鼠腹主動脈的ACh舒張百分比曲線差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B組大鼠的腹主動脈對于ACh的舒張反應小于A組(圖1B)。采用兩種方法導出的A組大鼠腹主動脈在不同濃度梯度ACh作用下的劑量-舒張百分比曲線相近，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.645，圖1C)。同樣，采用兩種方法導出的B組大鼠腹主動脈的ACh舒張百分比曲線相近，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.793，圖1D)。

圖1 腹主動脈舒張功能測量A.采用傳統(tǒng)儀器測量大鼠腹主動脈舒張功能；B.采用新型儀器測量大鼠腹主動脈舒張功能；C.兩種方法繪制的A組大鼠腹主動脈劑量-舒張曲線比較；D.兩種方法繪制的B組大鼠腹主動脈劑量-舒張曲線比較

2.腹主動脈收縮功能檢測結(jié)果：采用傳統(tǒng)儀器導出的A、B組大鼠腹主動脈對于KCl的時間-收縮百分比曲線差異無統(tǒng)計學意義(P=0.993，圖2A)。采用新型儀器導出的兩組大鼠腹主動脈對于KCl的時間-收縮百分比曲線比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.472，圖2B)。采用兩種方法導出的A組大鼠腹主動脈對于KCl的時間-收縮百分比曲線相近，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.320，圖2C)。同樣，采用兩種方法導出的B組大鼠腹主動脈對于KCl的時間-收縮百分比曲線相近，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.992，圖2D)。

圖2 腹主動脈收縮功能測量A.采用傳統(tǒng)儀器測量大鼠腹主動脈收縮功能；B.采用新型儀器測量大鼠腹主動脈收縮功能；C.兩種方法繪制的A組大鼠腹主動脈時間-收縮曲線比較；D.兩種方法繪制的B組大鼠腹主動脈時間-收縮曲線比較

3.子宮動脈收縮功能檢測結(jié)果：采用新型儀器導出的兩組大鼠子宮動脈對于KCl的時間-收縮百分比反應曲線相近，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.999，圖3A)。

4.子宮動脈舒張功能檢測結(jié)果：采用新型儀器導出的兩組大鼠子宮動脈的ACh的舒張百分比曲線比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B組大鼠的子宮動脈對于ACh的舒張反應小于A組(圖3B)。

圖3 子宮動脈舒縮功能測量A.采用新型儀器測量大鼠子宮動脈收縮功能；B.采用新型儀器測量大鼠子宮動脈舒張功能

5.組織學評估：采用新型儀器檢測過的大鼠腹主動脈(圖4A、圖4C)以及子宮動脈(圖4E、圖4F)，血管壁完整，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜損傷；而采用傳統(tǒng)儀器測量的大鼠腹主動脈(圖4B、圖4D)可發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)膜甚至血管平滑肌的損傷。

討 論

圖4 組織學評價A.采用新型儀器測量的A組大鼠腹主動脈；B.采用傳統(tǒng)儀器測量的A組大鼠腹主動脈；C.采用新型儀器測量的B組大鼠腹主動脈；D.采用傳統(tǒng)儀器測量的B組大鼠腹主動脈；E.采用新型儀器測量的A組大鼠子宮動脈；F.采用新型儀器測量的B組大鼠子宮動脈

微小動脈的功能改變可能直接影響下游靶器官，因此在研究中更多采用外周微小動脈而不是中央大動脈作為靶器官功能改變的上游研究對象[9,10]。傳統(tǒng)的雙金屬絲掛鉤式微小動脈功能測量裝置存在如下缺陷：(1)忽略了血管口徑和血管壁的厚度差異，對血管環(huán)各部分所造成的牽拉程度不一致，得到的數(shù)據(jù)無法真實的反應實際情況[1,11～13]。(2)傳統(tǒng)檢測儀的金屬絲直徑約100μm左右，易對血管內(nèi)膜造成損傷，當被測動脈內(nèi)徑小于300μm時，很難將兩根金屬絲同時穿入血管環(huán)[8～12]。若縮小金屬絲口徑，過細的金屬絲無法承受血管環(huán)的拉力。(3)忽略了血管腔內(nèi)血壓對血管內(nèi)壁的影響。(4)在裝置內(nèi)，血管腔內(nèi)外的生物活性液是相交通的，施加干預時，無法分辨干預因素是對外膜起效還是對內(nèi)膜起效。(5)金屬絲本身的性質(zhì)差異有可能影響實驗的結(jié)果[14～16]。

采用雙針套接式微血管測量裝置可以不受上述因素影響，其優(yōu)勢如下：(1)可精確模擬生理或病理狀態(tài)的血管腔內(nèi)血壓，并可自由調(diào)整被測血管的前負荷。(2)可測量口徑300μm以下的微小動脈。本實驗中被測量的微小動脈的最小口徑為230μm。套接軟針針頭組件可以根據(jù)被測血管的口徑進行個體化更換。(3)采用本裝置進行實驗時，操作僅限于血管段的兩端，中間段被測血管的內(nèi)膜不會受到損傷。(4)血管腔內(nèi)的生物活性液與恒溫浴槽內(nèi)的生物液不相交通，可以對被測血管的外膜和內(nèi)膜獨立施加干預因素。

本研究顯示，妊娠期大鼠，不論子宮動脈還是腹主動脈，對于ACh介導的舒張性均小于未孕的大鼠，提示在妊娠狀態(tài)下，大鼠動脈對ACh 誘導的內(nèi)皮依賴性舒張明顯降低，間接說明在妊娠狀態(tài)下，大鼠血管內(nèi)皮舒張功能下調(diào)，更易引發(fā)妊娠期高血壓。比較腹主動脈和子宮動脈，妊娠期ACh 誘導的內(nèi)皮依賴性舒張差異無統(tǒng)計學意義。既往研究報道在缺血、缺氧的妊娠大鼠模型中，大鼠主動脈對于ACh誘導的舒張功能顯著下降，提示缺血、缺氧狀態(tài)導致了血管內(nèi)皮舒張功能障礙，從而進一步加劇妊高癥的發(fā)展[17]。而本研究結(jié)果提示，妊娠狀態(tài)本身也許就是妊高癥的獨立誘因。對于KCl誘導的收縮，不論是腹主動脈還是子宮動脈，兩組均未表現(xiàn)出差異，提示在妊娠期，KCl介導的電壓門鈣通道可能未受影響，或者有其他通路代償了該通路的功能。本研究將同組的大鼠腹主動脈用兩種方法測量，不管是對于KCl誘導的時間-收縮曲線，還是ACh誘導的劑量-舒張曲線，兩種方法測得的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學意義，提示新的測量方法與已認可的傳統(tǒng)方法比較，差異無統(tǒng)計學意義。同時，采用同種測量方法測量不同組的大鼠腹主動脈，對于傳統(tǒng)測量方法已測得的差異，采用新測量儀器同樣可測出相同趨勢的差異。對于口徑小于300μm的微小血管在妊娠期血管內(nèi)皮舒縮功能改變的報道鮮見。筆者選取口徑為200～300μm的大鼠子宮動脈作為研究對象，用新型儀器繪制其對KCl及ACh的反應曲線，結(jié)果顯示雌性大鼠子宮動脈對于ACh介導的內(nèi)皮舒張功能在妊娠期顯著下調(diào)，填補了此領域空白。

當然，本研究也存在不足之處：(1)測量指標有限。在后繼的研究中，筆者還將加入左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(indomehacin)等干預因素，使實驗趨向系統(tǒng)性[10,13,18,19]。(2)選取的微小動脈較單一。

綜上所述，本研究所述的雙針套接式微小動脈測量裝置不僅可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的微小動脈測量儀，還可以測量傳統(tǒng)儀器無法測量的口徑更小的微小動脈，擁有廣泛的應用前景，有望成為臨床以及藥理實驗中測量血管功能的主流裝置。