轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中白藜蘆醇的提取工藝

馬伯寧,韋航濤，劉 佳，項(xiàng) 晨，楊明峰

(北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

白藜蘆醇(Resveratrol)是一種廣泛存在于葡萄、虎杖等植物或果實(shí)當(dāng)中的二苯乙烯類多酚化合物，難溶于水，易溶于乙醇等極性溶劑[1]。自1940年日本學(xué)者從毛葉黎蘆根部分離得到白藜蘆醇開始[2]，發(fā)現(xiàn)它不但是一種植保素，而且有保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗氧化等作用[3-4]。

目前生產(chǎn)白藜蘆醇的主要途徑是通過生物系統(tǒng)表達(dá)、化學(xué)合成或從天然植物材料中提取[5]。生物系統(tǒng)表達(dá)法和天然植物材料提取法產(chǎn)量相對較低，主要是受到生物量和提取工藝的限制。化學(xué)方法合成此類天然產(chǎn)物雖產(chǎn)量高，但是合成過程中會(huì)引入有害化學(xué)物質(zhì)[5]。

天然植物材料中的白藜蘆醇常用輔助溶劑提取法獲得。張煥麗等采用超聲波輔助溶劑提取法，從巨峰葡萄皮中提取白藜蘆醇，但是溶劑提取和超聲輔助條件因植物種類不同而異[6]。陶志杰等利用酶解輔助和乙醇提取花生芽莖白藜蘆醇，分析了酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH值等因素對提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)酶解輔助提高了1.8倍白藜蘆醇提取量，但酶解時(shí)間過久反而導(dǎo)致提取量下降[7]。

萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一種單細(xì)胞藻類，具有培養(yǎng)條件簡單、生長迅速、光合效率高等特點(diǎn)，常在植物代謝研究時(shí)作為模式材料使用[8-9]。本研究旨在探索一種從萊茵衣藻中提取白藜蘆醇的有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為能夠積累白藜蘆醇的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻[10]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萊茵衣藻的培養(yǎng) 使用TAP培養(yǎng)基對萊茵衣藻進(jìn)行培養(yǎng)。TAP培養(yǎng)基：25 mL/L TAP鹽、2.42 g/L Tris、1 mL/L磷酸緩沖液(pH=5.0)、1 mL/L精氨酸、1 mL/L微量元素，加去離子水定容后，用冰醋酸將pH調(diào)至6.0左右。萊茵衣藻在溫度為25 ℃、光照強(qiáng)度為30 μmol/m2·s、光周期 16 h/8 h(光/暗)的條件下在TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每7 d繼代1次。

1.2.2 白藜蘆醇的提取 衣藻藻液4 ℃下8 000r/min離心5 min，收集1 g藻體備用。在pH=6.0左右的條件下，進(jìn)行5組試驗(yàn)。每組中加入相同量的纖維素酶，并分別進(jìn)行3、6、9、12 h的酶解。酶解后用200 mL體積分?jǐn)?shù)為60 %的甲醇作為提取劑在60 ℃條件下提取6 h。接著進(jìn)行減壓抽濾并在4 ℃、800 r/min條件下離心5 min。吸取適量上清到2 mL離心管中并稀釋，用0.22 μm的濾膜過濾、超聲除氣泡后，使用高效液相色譜法分析白藜蘆醇含量。第二組對照試驗(yàn)用以上試驗(yàn)方法測定體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、70%的甲醇對白藜蘆醇提取量的影響。第三組試驗(yàn)在其他條件為預(yù)設(shè)值時(shí)，測定提取溫度為40、50、70 ℃白藜蘆醇提取量。第四組按照同樣的方法測定提取時(shí)間3、9、12 h時(shí)的白藜蘆醇提取濃度。最后按照以上分析得到的最佳方案進(jìn)行兩組試驗(yàn)：對照組不添加底物，試驗(yàn)組加入一定量的底物肉桂酸，以測定底物對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響。

1.2.3 高效液相色譜法測定白藜蘆醇產(chǎn)量 使用Waters 1525高效液相色譜儀，并使用Angilent ZORBAX SB-C18 250 mm反相色譜柱進(jìn)行檢測，柱溫設(shè)定25.0 ℃。高效液相色譜方法：流速0.8 mL/min，流動(dòng)相為甲醇(A)和水(B)。使用濃度為10%～70%的甲醇梯度洗脫30 min，接著保持甲醇濃度70 %洗脫10 min。白藜蘆醇檢測波長為305.6 nm。 白藜蘆醇標(biāo)品配制成100 μg/mL的母液，然后稀釋成5個(gè)濃度梯度：2.5、5、12.5、25、50 μg/mL，過濾分裝后進(jìn)行超聲除氣泡并各取10 μL依次進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)孫同天的N+(N-1)規(guī)則進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]。共有4個(gè)因素，分別是：酶解時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間。每個(gè)因素分別進(jìn)行了4個(gè)水平的檢測。試驗(yàn)指標(biāo)定為白藜蘆醇提取濃度。通過查閱文獻(xiàn)[12]，暫定本試驗(yàn)最佳的提取方案為：取一定量的萊茵衣藻進(jìn)行9 h酶解后超聲萃取30 min，接著用60%的甲醇溶液在60 ℃條件下提取6 h(表1)。

表1 試驗(yàn)結(jié)果表Tab.1 Experimental results

注: ±表示暫定的最佳試驗(yàn)方案；DW 表示干重

Note：± indicates the provisional best protocol；DW indicates dry weight

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過高效液相色譜法檢測配制的白藜蘆醇標(biāo)品，其質(zhì)量濃度為2.5～100 μg/mL，記錄白藜蘆醇質(zhì)量濃度與檢測峰面積的數(shù)據(jù)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相關(guān)性方程：y=666 50x-439 16,R2=0.999 5。公式中y為峰面積，x為白藜蘆醇質(zhì)量濃度(μg/mL)，由此公式可以將液相色譜中的峰面積數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇質(zhì)量濃度。白藜蘆醇的出峰時(shí)間約為12 min(圖1)。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)品(100 μg/mL)高效液相色譜結(jié)果Fig.1 High performance liquid chromatography results of standard resveratrol samples (100 μg/mL)

2.2 酶解時(shí)間對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響

在其他提取條件一定的情況下，考察提取反應(yīng)中酶解時(shí)間對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響，在第12 min時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)物峰(圖2-A,B,C,D)。

A.酶解時(shí)間3 h；B.酶解時(shí)間6 h；C.酶解時(shí)間9 h；D.酶解時(shí)間12 h；E不同酶解時(shí)間時(shí)的白藜蘆醇提取濃度圖2 酶解時(shí)間高效液相色譜結(jié)果A,time of enzymatic hydrolysis for 3 hours; B,time of enzymatic hydrolysis for 6 hours; C,time of enzymatic hydrolysis for 9 hours; D,time of enzymatic hydrolysis for 12 hours；E,concentrations of resveratrol at different enzymatic hydrolysis timeFig.2 High performance liquid chromatography results of various enzymatic hydrolysis time

在其他條件一定的情況下，酶解時(shí)間9 h時(shí)，提取的產(chǎn)物濃度最高，白藜蘆醇濃度為8.57 μg/g DW (圖2-E)。提取時(shí)間在3～9 h時(shí)，產(chǎn)物濃度隨提取時(shí)間增加而增加，并且在9 h左右，產(chǎn)物濃度達(dá)到最大值，之后隨時(shí)間增長而下降。由此可以看出在酶解時(shí)間為9 h左右時(shí)，萊茵衣藻細(xì)胞壁完全被酶解，細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)物完全釋放，白藜蘆醇的提取量達(dá)到最大值。有研究表明，白藜蘆醇在日光照射一定時(shí)間后，306 nm處吸光值下降[13]。本試驗(yàn)中萊茵衣藻的酶解反應(yīng)在室內(nèi)無日光直射的條件下進(jìn)行。隨著酶解時(shí)間的增長，萊茵衣藻細(xì)胞壁被酶解，白藜蘆醇從細(xì)胞內(nèi)釋放出來所以檢測到白藜蘆醇提取量逐漸增加。但是9 h后細(xì)胞內(nèi)白藜蘆醇全部酶解到反應(yīng)液中，在室內(nèi)光照條件下白藜蘆醇也會(huì)發(fā)生變化，所以導(dǎo)致306 nm處吸光度值下降，提取濃度降低。由以上分析最終選擇9 h作為酶解時(shí)間的條件。

2.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響

在其他提取條件一定的情況下，考察提取介質(zhì)中甲醇體積分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響。經(jīng)過高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)，甲醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)提取的產(chǎn)物濃度達(dá)到最大值，306 nm處峰面積最大，白藜蘆醇濃度為8.57 μg/g (圖3-A)。因此選擇使用甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%作為該項(xiàng)因素的最佳濃度。

A.甲醇體積分?jǐn)?shù)；B.提取溫度；C.提取時(shí)間；D.是否添加底物，試驗(yàn)組別中1、3、5、7為對照組，不添加底物；2、4、6、8為試驗(yàn)組，添加10 μg/mL肉桂酸作為底物圖3 不同條件下的白藜蘆醇提取濃度A, methanol concentrations; B,extraction temperatures; C, extraction time; D, with and without substrate; the control group 1,3,5,and 7 without substrate; the experimental groups 2,4,6,and 8 with 10 μg/mL cinnamic acid as a substrateFig.3 Concentration of resveratrol with different extraction conditions

2.4 提取溫度對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響

在其他提取條件一定的情況下，考察提取溫度對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在60 ℃溫度條件下，產(chǎn)物提取量最大，可達(dá)8.57 μg/g DW(圖3-B)。隨著提取溫度的提升，產(chǎn)物濃度降低。由此可知雖然溫度提升時(shí)，白藜蘆醇溶解度增加，但是溫度過高白藜蘆醇會(huì)因?yàn)樽陨淼臒岵环€(wěn)定性導(dǎo)致提取濃度降低[13]，所以提取溫度60 ℃為宜。

2.5 提取時(shí)間對萊茵衣藻中白藜蘆醇提取率的影響

在其他提取條件一定的情況下，考察提取時(shí)間對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響。經(jīng)過HPLC檢測后發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間為9 h時(shí)，得到的白藜蘆醇產(chǎn)量最高，最大值為8.95 μg/g DW (圖3-C)。此后增加提取時(shí)間卻發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇產(chǎn)量并沒有太大變化。分析可能是由于提取時(shí)間為9 h時(shí)產(chǎn)物被完全提取出來，所以增加提取時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的量發(fā)生明顯變化。

2.6 肉桂酸對萊茵衣藻中白藜蘆醇產(chǎn)量的影響

對在其他條件一定的情況下進(jìn)行兩組試驗(yàn)，分別為對照組和加入底物試驗(yàn)組。由圖中可以看出編號為2、4、6、8的添加底物試驗(yàn)組中白藜蘆醇提取量高于其他的對照組，其提取濃度最大值為15.31 μg/g DW (圖3-D)。

白藜蘆醇在植物體內(nèi)由苯丙烷代謝途徑合成，其中肉桂酸是合成白藜蘆醇的重要底物。萊茵衣藻能通過自身代謝反應(yīng)得到的底物肉桂酸產(chǎn)量不多。當(dāng)存在白藜蘆醇合酶的條件下，白藜蘆醇合酶要利用該底物，可能存在對底物的競爭從而導(dǎo)致底物不足的情況。因此為了增加白藜蘆醇產(chǎn)量，加入一定量的底物肉桂酸是一種有效的方法。

3 討 論

自從1940年首次從毛葉藜蘆的根部分離得到了白藜蘆醇開始，揭開了人們對這個(gè)植物次生代謝產(chǎn)物的探究。1963年Nonomura等認(rèn)為某些草藥中治療炎癥和心血管相關(guān)疾病的有效成分可能是白藜蘆醇[14]。1976年又發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在植物受到機(jī)械損傷或紫外線照射時(shí)表達(dá)量會(huì)大量增加，因此被稱為植保素[15]。

目前己經(jīng)在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了白藜蘆醇，而這些植物多為常見的藥用植物[16]。由于白藜蘆醇是植物次生代謝產(chǎn)物，目前主要是從葡萄籽、葡萄皮、中藥虎杖中提取白藜蘆醇，通過不同的方法從植物中提取白藜蘆醇也成了當(dāng)下生物合成白藜蘆醇關(guān)注的熱點(diǎn)。前人文獻(xiàn)報(bào)道了溶劑提取法、酶法提取、微波萃取、超臨界CO2萃取、超聲波提取等方法提取白藜蘆醇。生物合成法獲得白藜蘆醇的主要制約因素是生物量和提取方法。本試驗(yàn)使用的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻能夠代謝產(chǎn)生白藜蘆醇，并且萊茵衣藻具有生長繁殖快、周期短、生物量大等優(yōu)點(diǎn)，所以通過轉(zhuǎn)基因衣藻可以大量并且快速產(chǎn)生白藜蘆醇。

在提取方法上，本研究參考已報(bào)道的試驗(yàn)方法，考慮到試驗(yàn)可行性、簡便程度、提取效率等因素，根據(jù)白藜蘆醇提取產(chǎn)量優(yōu)化提取方法 (表1)。編號為12的試驗(yàn)組得到的白藜蘆醇濃度最高，其酶解時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度三個(gè)因素與預(yù)期最佳水平結(jié)果一致，因此這三個(gè)因素的水平確定為預(yù)設(shè)值。提取時(shí)間的最佳水平為9 h并非之前預(yù)設(shè)的6 h，但提取時(shí)間為9 h時(shí)得到的白藜蘆醇濃度為8.95 μg/g DW，與6 h提取得到的白藜蘆醇濃度8.57 μg/g DW并沒有明顯的增加。本著節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間的原則，選定6 h作為提取時(shí)間的條件。

綜合試驗(yàn)結(jié)果，針對轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻探索出了一套完整的白藜蘆醇提取方法：收集藻液進(jìn)行9 h酶解處理后，超聲萃取30 min，使用60%甲醇溶液作為提取劑，在60 ℃條件下提取6 h，從萊茵衣藻中提取出的產(chǎn)物白藜蘆醇的量為8.57 μg/g DW。添加終濃度為10 μg/mL肉桂酸作為底物，則提取白藜蘆醇的產(chǎn)量可達(dá)15.31 μg/g DW?？傊?，本研究優(yōu)化得到了一種從藻類植物中提取白藜蘆醇相對高效的方法，為研究轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的白藜蘆醇相關(guān)代謝提供了基礎(chǔ)，也為轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中提取白藜蘆醇提供了一種有效的方法。