細(xì)胞自噬、凋亡和壞死性凋亡的分子關(guān)系

劉超英 高洪 嚴(yán)玉霖

摘要：大量潛在的致死因素能夠?qū)?xì)胞造成損傷，這些因素可以通過激活特殊的分子通路進(jìn)而殺死細(xì)胞。有些死亡方式是根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化來(lái)定義的，但更多的是通過相關(guān)調(diào)控分子的作用而進(jìn)行明確定義。隨著對(duì)細(xì)胞死亡越來(lái)越深入透徹的研究，多種不同的細(xì)胞死亡通路也得到了更加全面、徹底的闡述，它們之間存在的分子關(guān)系也成為研究和爭(zhēng)議的熱點(diǎn)。本文通過闡明自噬和壞死性凋亡的分子通路及發(fā)生原理，對(duì)兩者控制細(xì)胞死亡的特殊分子途徑的不同特征及它們之間的分子關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)描述。

關(guān)鍵詞：自噬;凋亡;壞死性凋亡;半胱天冬酶

中圖分類號(hào)： Q255文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0006-03

收稿日期：2018-04-09

自噬是一種“自食”的胞內(nèi)機(jī)制。在這一過程中，蛋白和細(xì)胞器被特殊的胞內(nèi)囊泡包裹，并在溶酶體內(nèi)蛋白酶的作用下徹底裂解后供細(xì)胞重新利用。大多數(shù)細(xì)胞在休眠狀態(tài)下會(huì)發(fā)生低水平的自噬。某些刺激因素能夠提高自噬的概率，如營(yíng)養(yǎng)匱乏等。自噬小體的囊泡能夠以非特異性（如大自噬）或特異性（如線粒體自噬）的方式包裹細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物。UNC-51樣激酶（UNC-51-like kinase，簡(jiǎn)稱ULK）蛋白復(fù)合體能夠誘導(dǎo)自噬小體的形成，也會(huì)受到哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，簡(jiǎn)稱mTOR）途徑的負(fù)調(diào)控，而mTOR是1個(gè)主要的營(yíng)養(yǎng)傳感器。因此，生長(zhǎng)因子和氨基酸的缺失以及化學(xué)抑制劑雷帕霉素都可以利用這一通路引發(fā)細(xì)胞自噬。ULK能夠促進(jìn)自噬小體膜的形成，并激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatylinositol 3-kinase，簡(jiǎn)稱PI3K）復(fù)合體Ⅲ，PI3K抑制劑能夠在早期抑制自噬的發(fā)生。

1自噬與細(xì)胞死亡的關(guān)系

促生存BCL-2蛋白家族成員（the pro-survival B cell lymphoma 2 family members）是BH3（BCL-2 homology 3）擬態(tài)混合物ABT-737的靶標(biāo)，這些家族成員能夠通過結(jié)合自噬蛋白Beclin1（BECN1/ATG6/VPS30）的BH3樣結(jié)構(gòu)域直接抑制細(xì)胞自噬。當(dāng)Beclin 1過表達(dá)時(shí)，BCL-2能夠與Beclin 1發(fā)生免疫共沉淀。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，促生存的BCL-2蛋白家族對(duì)自噬的抑制主要依賴于固有凋亡途徑功能的完整性。當(dāng)固有凋亡途徑由于BAX基因和BAK基因的敲除而徹底失去功能時(shí)，抗凋亡BCL-2家族成員的過表達(dá)便無(wú)法通過一系列刺激阻止自噬的激活[1]。因此，與BAX和BAK基因?qū)ψ允傻莫?dú)立調(diào)控相反，BCL-2家族成員或BH3擬態(tài)對(duì)自噬的調(diào)控是間接的。在BAX和BAK基因敲除的細(xì)胞中，DNA嵌入劑依托泊苷也能夠引起自噬反應(yīng)，然而，藥物是否會(huì)因?yàn)樽允啥鸺?xì)胞死亡尚未知。關(guān)鍵自噬基因的敲除是將自噬的功能作為一種細(xì)胞死亡類型最清晰的方式。例如，可以通過將Bax-/-、Bak-/-和ATG5-/-型細(xì)胞與3種基因均缺陷的細(xì)胞進(jìn)行比較，從遺傳學(xué)上區(qū)分自噬性細(xì)胞死亡。有研究表明，在果蠅發(fā)育期間移除中腸結(jié)構(gòu)后，即使在缺乏含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的情況下，也能夠發(fā)生自噬現(xiàn)象。在這些試驗(yàn)條件下對(duì)自噬基因進(jìn)行沉默，結(jié)果表明，自噬的發(fā)生主要是為了消除細(xì)胞，并不依賴于caspase的活性?？偟膩?lái)說(shuō)，自噬途徑是一種細(xì)胞保存和重復(fù)利用資源的機(jī)制，可促進(jìn)細(xì)胞死亡。有研究表明，外在的細(xì)胞死亡途徑中的分子可在自噬的調(diào)控中起作用。因此可見，細(xì)胞死亡途徑和自噬途徑應(yīng)該可以在多水平上互作。

2凋亡與壞死性凋亡的關(guān)系

壞死是一種不可調(diào)控的細(xì)胞毒素性損傷結(jié)果，其發(fā)生不需要特殊的分子作用。然而，在最近10年中，人們發(fā)現(xiàn)了1種可調(diào)控形式的壞死性細(xì)胞死亡，并將其稱為壞死性凋亡，因?yàn)樗婢叩蛲龊蛪乃赖奶卣?。壞死性凋亡不僅是一種特定的分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)控制的過程，也具有細(xì)胞和細(xì)胞器腫脹導(dǎo)致細(xì)胞裂解的特征。裂解后釋放的大量細(xì)胞內(nèi)容物可作為損傷相關(guān)分子模型（damage-associated molecular patterns，簡(jiǎn)稱DAMPs），例如mt DNA、HMGB1、IL-33、IL-1或S100a9等，均能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[2]。壞死性凋亡與大量的炎癥病理相關(guān)，如胰腺炎、腸炎和疾病感染等[3-7]。

1998年，Vercammen等首次在以腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，簡(jiǎn)稱TNF-α）或Fas L以及caspase抑制劑處理的鼠科L929纖維原細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了壞死性凋亡特征[7-8]。后來(lái)的研究表明，在出現(xiàn)多種刺激的情況下，如TNF受體的信號(hào)通路、T細(xì)胞受體刺激、干擾素、一些抗癌藥物、病原相關(guān)分子模式激活RIG-Ⅰ樣或Toll樣受體、遺傳毒性或氧化應(yīng)激、病毒介導(dǎo)的干擾素（IFN）調(diào)控因子的DNA依賴性激活劑（DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，簡(jiǎn)稱DAI）的激活等，尤其是caspase8的抑制能夠引起壞死性凋亡的發(fā)生[9-10]。壞死性凋亡的發(fā)生過程需要絲氨酸/蘇氨酸受體互作蛋白激酶1（receptor interacting protein kinases 1，簡(jiǎn)稱RIPK1）和RIPK3，以及混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed lineage kinase like，簡(jiǎn)稱MLKL）的參與。目前認(rèn)為，壞死性凋亡是一種由受體互作蛋白（receptor interacting protein，簡(jiǎn)稱RIP）激酶和混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed lineage kinase like，簡(jiǎn)稱MLKL）介導(dǎo)的caspase依賴性細(xì)胞死亡。從試驗(yàn)角度來(lái)講，這通常與caspase抑制劑的使用或RIPK3/MLKL的敲除、沉默有關(guān)。

大多數(shù)報(bào)道的壞死性凋亡刺激都是由于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，簡(jiǎn)稱TNF）的產(chǎn)生和與腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，簡(jiǎn)稱TNFR1）相關(guān)信號(hào)通路的激活能夠刺激壞死性凋亡的發(fā)生。在試驗(yàn)設(shè)置中，TNFR1的信號(hào)通路中caspase8和cIAPs的活性受到抑制時(shí)會(huì)促進(jìn)壞死性凋亡的發(fā)生。TNF與TNFR1的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致cIAPs作用下的受體互作蛋白激酶Ⅰ（receptor interacting protein kinase Ⅰ，簡(jiǎn)稱RIPK1）的多聚泛素化，從而在空間上限制RIPK1形成細(xì)胞死亡復(fù)合體。當(dāng)cIAPs缺失或利用凋亡抑制劑（inhibitor of apoptosis，簡(jiǎn)稱IAP）處理降解cIAPs后，1種稱作RIPoptosome的細(xì)胞死亡信號(hào)復(fù)合體就會(huì)形成，由去泛素化的RIPK1、Fsa相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（fas associated death domain，簡(jiǎn)稱FADD）、caspase8和FADD樣白介素1β轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白[FADD like interleukin-1β converting enzyme （FLICE） inhibitory protein，簡(jiǎn)稱cFLIP]組成[11-12]。在這種動(dòng)態(tài)變化中，細(xì)胞的存活主要依賴于caspase8的活性。RIPK1和RIPK3是caspase8的底物，在胚胎發(fā)育和炎癥反應(yīng)中，它們的裂解能夠引發(fā)凋亡，阻止大面積的壞死[13-14]。

在caspase8失活的情況下，RIPK1和RIPK3不再發(fā)生裂解，兩者能夠通過其RHIM結(jié)構(gòu)域發(fā)生互作，并作為激酶啟動(dòng)壞死性凋亡[15]。壞死小體是由RIPK1、RIPK3與MLKL共同組成的復(fù)合物[16]。其中，RIPK1能夠使RIPK3發(fā)生磷酸化，進(jìn)而使MLKL磷酸化，直接引發(fā)細(xì)胞死亡。一旦發(fā)生磷酸化，假激酶MLKL會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，從而將1個(gè)特殊的4螺旋束結(jié)構(gòu)域插入細(xì)胞質(zhì)膜，破壞質(zhì)膜的完整性[17-19]。最新的研究表明，RIPK1可以通過控制RIPK3的寡聚化抑制自發(fā)的RIPK3激活。然而，缺乏RIPK1的細(xì)胞會(huì)增加自發(fā)的RIPK3依賴性的壞死性凋亡，而以壞死性凋亡抑制劑處理后的細(xì)胞就不會(huì)發(fā)生壞死性凋亡[20-21]。圍產(chǎn)期致命性的Ripk1基因缺陷小鼠在缺失Ripk3或Mlkl后會(huì)得到改善，這就表明RIPK1非依賴性（RIPK3/MLKL依賴性）壞死性凋亡的存在，這與前面的結(jié)論一致。Ripk1基因的敲除不能治療caspase8缺陷型小鼠，而RIPK3的基因缺失可以治療，這一事實(shí)就證明了上述想法[22-23]。進(jìn)一步的研究表明，由TLR3/4或MCMV引起的壞死性凋亡不依賴于RIPK1[10，24]。

由RIP蛋白凋亡體的組分造成的caspase依賴性和非依賴性的死亡應(yīng)答，仍存在其他水平上的交叉調(diào)控，目前很多RIP蛋白凋亡體還沒有研究透徹。例如，cFLIP的長(zhǎng)同分異構(gòu)體cFLIPL與caspase8形成了1種具有催化活性的異質(zhì)二聚體，能夠改變caspase8底物特異性的光譜[25]。該二聚體能夠通過抑制RIPK3來(lái)抑制壞死性凋亡[26]。相反，cFLIP的短同分異構(gòu)體cFLIPs可抑制caspase8的活性并能在缺乏cIAPs的情況下促進(jìn)壞死性凋亡復(fù)合體的形成[11-12]。最新研究表明，RIPK3和FADD的共缺失能夠使cFLIP致死性基因型敲除小鼠存活，但若僅其中1個(gè)缺失，小鼠便會(huì)死亡[27]。凋亡與壞死性凋亡的另1個(gè)分子共調(diào)控的例子就是頭帕腫瘤綜合征蛋白（cylindromatosis，簡(jiǎn)稱CYLD）基因。這一基因編碼了1種具有去泛素化功能的細(xì)胞質(zhì)蛋白，在全基因組掃描中將其作為一種壞死調(diào)節(jié)器。CYLD能夠通過促進(jìn)RIPK1在TNFR1膜受體復(fù)合物中的去泛素化而促進(jìn)壞死性凋亡[28]。caspase8能夠通過裂解CYLD抑制壞死性凋亡[29]。總的來(lái)說(shuō)，這些例子可以表明，壞死性凋亡和固有的凋亡途徑以一種復(fù)雜而有趣的方式進(jìn)行緊密結(jié)合并相互協(xié)調(diào)。各種細(xì)胞死亡方式之間的共調(diào)控與這些復(fù)雜的互作之間的不同作用都有待研究。

3自噬和壞死性凋亡的分子關(guān)系

在多種細(xì)胞死亡方式的復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)中，自噬和壞死性凋亡途徑之間的互作關(guān)系目前尚不十分清楚。不過，已經(jīng)有數(shù)據(jù)證明了這些互作關(guān)系。在小鼠纖維原L929細(xì)胞的研究中，僅僅是pan-caspase抑制劑zVAD處理就可以引發(fā)細(xì)胞死亡。部分特征就是自噬小體液泡的形成。由于RIPK1、ATG7或Beclin-1表達(dá)量的降低抑制了死亡應(yīng)答，所以試驗(yàn)數(shù)據(jù)一方面說(shuō)明了這些自噬基因有助于壞死性凋亡細(xì)胞死亡，另一方面說(shuō)明caspase激活能夠抑制自噬性細(xì)胞死亡。對(duì)遺傳改良小鼠T細(xì)胞的研究表明，T細(xì)胞激活后，1個(gè)由FADD和caspase8構(gòu)成的DISC樣復(fù)合體會(huì)與RIPK1在自噬小體膜上進(jìn)行組裝。ATG5和FADD之間的蛋白-蛋白互作是這一復(fù)合體組裝的關(guān)鍵。在功能的水平上，這一模型表明，自噬的某些水平需要正常增殖的T細(xì)胞應(yīng)答。FADD、caspase8和RIPK1都調(diào)控著應(yīng)答的程度，因?yàn)镕ADD和caspase8的敲除增強(qiáng)了自噬，鈍化了增殖，同時(shí)壞死性凋亡抑制劑對(duì)RIPK1的抑制能夠在缺乏正常FADD功能的T細(xì)胞中恢復(fù)增殖應(yīng)答。最新的研究表明，RIPK3的缺失也能夠重建細(xì)胞增殖[30]。這一調(diào)控水平可檢測(cè)在克隆繁殖中1種引起T細(xì)胞死亡的非調(diào)控性自噬發(fā)生的可能性。此外，這些數(shù)據(jù)表明，caspase8活性的調(diào)控在T細(xì)胞增殖應(yīng)答的調(diào)控中具有重要作用。其他受體信號(hào)系統(tǒng)中的自噬和壞死性凋亡途徑交叉調(diào)控仍需要進(jìn)一步的研究。

4結(jié)論

相同的有害損傷能夠通過不同的分子途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡。一些信號(hào)途徑通過相同的分子匯集起來(lái)，這些交叉點(diǎn)都是可調(diào)控的，細(xì)胞可能通過這些點(diǎn)決定它們的死亡方式[31]。同時(shí)，有證據(jù)表明，某些胞內(nèi)應(yīng)激總是利用一種特定的細(xì)胞死亡途徑，例如BCL-2調(diào)控途徑。很明顯，其他細(xì)胞毒素應(yīng)答也參與多種機(jī)制，細(xì)胞死亡可以通過這些機(jī)制被引發(fā)。自噬和壞死性凋亡的交叉點(diǎn)是分子病理學(xué)中比較有趣而且容易擴(kuò)展研究的部分。有時(shí)生理學(xué)結(jié)果是細(xì)胞死亡，而激活細(xì)胞死亡途徑的因子表達(dá)量的降低，影響了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。自噬性細(xì)胞死亡和壞死性凋亡反應(yīng)的結(jié)果都是導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但兩者對(duì)相似刺激是否有不同的生理學(xué)結(jié)果仍有待確定，這仍是進(jìn)一步研究的熱門話題。

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