索拉非尼對胃癌細(xì)胞MGC80—3抑制作用實驗研究

陳怡　陳爍　鄭娟紅等

[摘要] 目的 探討索拉非尼對體外培養(yǎng)人胃癌MGC80-3細(xì)胞增殖和凋亡的作用以及作用機(jī)制。 方法 采用二苯基四氮唑溴鹽比色法（MTT法）檢測不同濃度索拉非尼作用人胃癌MGC80-3 細(xì)胞的抑制作用；AnnexinV/PI 雙染法觀察藥物處理后細(xì)胞凋亡率變化。 結(jié)果 索拉非尼對人胃癌MGC80-3細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 索拉非尼能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并隨濃度增高凋亡率增加。

[關(guān)鍵詞] 胃癌細(xì)胞；索拉非尼；凋亡；增殖

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）21-0008-03

[Abstract] Objective To explore the inhibitory effective and mechanism on the proliferation and apoptosis of sorafenib in vitro gastric cancer MGC80-3 cells. Methods The inhibitory effective of sorafenib at different concentrations for gastric cancer cell MGC80-3 were analyzed by MTT assay. Apoptosis rate was observed by AnnexinV/PI staining. Results The proliferation inhibition of sorafenib on gastric cancer MGC80-3 cell was time-dose dependent manner， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The apoptosis of gastric cancer MGC80-3 cells is different and the apoptotic rate is increased with the increase of sorafenib concentration.

[Key words] Gastric cancer cell； Sorafenib； Apoptosis； Proliferation

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居所有癌癥的第二位[1]。胃癌的早期診斷難，大多數(shù)胃癌診斷時已處于進(jìn)展期，除了手術(shù)治療以及放療或者保守化療外，尚無有效的治療方法。目前，藥物治療作為主要手段用于治療晚期胃癌。隨著胃癌分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，針對腫瘤細(xì)胞生長、凋亡、細(xì)胞周期、浸潤以及血管生成等分子靶點提出的靶向治療成為胃癌綜合治療的重點和熱點。研究顯示索拉非尼（sorafenib）是小分子多靶點、多激酶抗腫瘤藥，能同時抑制存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的激酶，包括RAF激酶、血管內(nèi)皮生長因子-2（VEGFR-2）、血管內(nèi)皮生長因子-3（VEGFR-3），具有雙重抗腫瘤效應(yīng)[2]。本研究通過觀察索拉非尼在體外對胃癌細(xì)胞株生物學(xué)活性的作用，了解其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胃癌MGC80-3細(xì)胞株購于武漢博士德生物工程有限公司，AnnexinV-FITC和PI檢測試劑盒購買于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，索拉非尼為德國拜耳公司生產(chǎn)，用10%二甲基亞砜（DMSO）溶解，于-20℃保存，實驗時稀釋。

1.2 實驗方法

1.2.1 胃癌MGC80-3細(xì)胞培養(yǎng) 在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 MTT檢測索拉非尼作用于MGC80-3細(xì)胞的抑制率 將細(xì)胞分別接種于96孔平底板，每孔接種5×105個細(xì)胞。實驗組分別加入不同濃度（S1：5 μmol/L、S2：10 μmol/L、S3：15 μmol/L、S4：20 μmol/L）的索拉非尼100 μL，并設(shè)不加藥物的對照組。加藥后分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，藥物終止作用后常規(guī)MTT法測生長抑制率，在自動酶標(biāo)儀490 nm波長處測定每孔的吸光度（A）值。細(xì)胞抑制率（%）=（1-用藥組平均A值）/陰性對照組平均A值×100%，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL接種于6孔板，每孔2 mL。加入含不同濃度（5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L）索拉非尼的RPMI 1640培養(yǎng)液作為實驗組，2 mL/孔，對照組僅加入等量培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按流式細(xì)胞檢測試劑盒說明書處理細(xì)胞，進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼不同用藥方式對MGC80-3細(xì)胞的抑制作用

索拉非尼對MGC80-3細(xì)胞有抑制作用，抑制作用隨著其濃度增高或作用時間延長而增強(qiáng)，呈劑量和時間依賴性（P<0.05）。見表1。

2.2 不同濃度索拉非尼對MGC80-3細(xì)胞凋亡率影響

索拉非尼作用48 h后在流式細(xì)胞儀得到的AnnexinV-FITC/PI雙染雙變量散點圖，索拉非尼作用MGC80-3細(xì)胞48 h出現(xiàn)凋亡呈濃度依賴性，在5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L的索拉非尼組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對照組S0的細(xì)胞凋亡率為（4.10±1.48）%，實驗組S1、S2、S3、S4的細(xì)胞凋亡率分別為（7.71±2.35）%、（13.49±2.10）%、（17.53±2.61）%、（26.15±5.49）%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），即隨著藥物濃度的增高，索拉非尼對MGC80-3細(xì)胞的促凋亡作用增強(qiáng)。見圖1。

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界第四位[3]。目前晚期胃癌的主要治療手段是化療，有效的化療藥物包括紫杉醇、蒽環(huán)類、鉑類等，但是并未從根本上提高化療有效率，生存期比較短[4]，60%的胃癌患者VEGF有表達(dá)，高表達(dá)者預(yù)后較陰性者差，其發(fā)生與發(fā)展過程由多因素參與完成，與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及新生血管增生異常等相關(guān)[5]。索拉非尼通過抑制RAF激酶，阻斷Raf/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖[6，7]，靶向作用于血管內(nèi)皮生長因子以及血小板源生長因子而抑制血管形成[8]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的失調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，血管形成，粘附以及侵襲和轉(zhuǎn)移，并能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。目前有多項應(yīng)用索拉非尼治療癌癥的臨床試驗正在進(jìn)行，有臨床研究顯示，索拉非尼在肺癌等腫瘤治療中具有較好的治療效果[9，10]。在治療肝癌中通過其抑制信號通路延長生存率[11]。在慢性粒細(xì)胞白血病等研究中不僅能抑制細(xì)胞生長，而且有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用[12，13]。

凋亡是細(xì)胞生長和老化過程中的正?，F(xiàn)象。不合適的細(xì)胞凋亡是引起許多疾病的一個因素包括結(jié)腸癌。誘導(dǎo)凋亡通過多種機(jī)制介導(dǎo)，比如抗癌藥物順鉑能夠與核酸起作用，引起復(fù)制停止，抑制轉(zhuǎn)錄，DNA損壞和凋亡[14]。胃癌的轉(zhuǎn)移途徑包括淋巴道轉(zhuǎn)移[15]、腹膜轉(zhuǎn)移[16]、血行轉(zhuǎn)移[17]等。

本實驗分析了索拉非尼在不同的濃度及不同時間均對胃癌MGC80-3細(xì)胞有抑制作用，呈時間-劑量依賴性。即索拉非尼濃度越高、作用時間越長對細(xì)胞增殖的抑制率越高。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示在給藥濃度為20 μmol/L時，細(xì)胞凋亡率為26.15%左右，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示索拉非尼對MGC80-3細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用，且隨濃度的增加凋亡率上升。本研究表明索拉非尼在體外可以直接抑制MGC80-3細(xì)胞的生長并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與相關(guān)報道[18，19]基本相似。

總之，體外實驗研究表明索拉非尼具有抑制胃癌MGC80-3細(xì)胞增殖作用，呈劑量和時間依賴性，還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。下一步將深入開展體外和體內(nèi)研究，進(jìn)一步探討其可能的具體作用途徑和機(jī)制，來證實索拉非尼對胃癌的治療有效性，為開展臨床研究提供可能的理論支持。

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（收稿日期：2015-01-26）