逆流色譜在外消旋體分離中的應(yīng)用

竺少銘，胡珊姍，王紅衛(wèi)，孔望欣

（浙江醫(yī)藥股份有限公司昌海生物分公司，浙江 紹興 312366）

0 引言

目前臨床上使用的很多藥物屬于手性藥物的消旋體，但手性藥物的不同對(duì)映體與生物大分子的作用表現(xiàn)不同，從而在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生不同的藥理、毒理、藥代、藥效作用。服用單一對(duì)映體可以減少藥物劑量和人體代謝負(fù)擔(dān)，減少與其他藥物的相互作用，提高活性并降低由某對(duì)映體產(chǎn)生副作用的可能性。現(xiàn)有的1327 種合成藥物中含有手性中心的有528 種，接近40%，然而以外消旋體形式銷售的手性藥物幾乎高達(dá)80%。美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）于1992 年規(guī)定，今后凡發(fā)展具有不對(duì)稱中心的藥物，必須給出手性拆分的結(jié)果。為了能準(zhǔn)確地了解藥效和安全用藥，發(fā)展和建立簡(jiǎn)單快速的手性藥物對(duì)映體的分離分析方法，并用于臨床研究和醫(yī)藥質(zhì)量控制，已成為醫(yī)藥界關(guān)注的重大課題。獲取手性藥物單一對(duì)映體的方法有外消旋體的拆分和不對(duì)稱合成（生物合成也算作不對(duì)稱催化合成）。由于不對(duì)稱合成的合成步驟煩瑣、反應(yīng)條件苛刻，外消旋體藥物或中間體的拆分成為獲取單一對(duì)映體的主要方法。外消旋體的拆分包括化學(xué)拆分、酶法拆分、色譜拆分和膜分離拆分。色譜分析技術(shù)是目前分離消旋體的主要方法之一[1-2]。采用HPLC 技術(shù)進(jìn)行手性異構(gòu)體的分離，需要將手性選擇試劑（CS）通過(guò)化學(xué)的手段鍵合在一種固體介質(zhì)上作為HPLC 分離的固定相，這種手性分離柱的制備價(jià)格昂貴，且需要一個(gè)費(fèi)時(shí)且復(fù)雜的過(guò)程；同時(shí)采用HPLC 法進(jìn)行制備性分離的溶劑消耗量也很大。因此尋求高效廉價(jià)的手性分離分析新方法成為研究的熱點(diǎn)。

逆流色譜作為色譜技術(shù)中的一種，起源于逆流分溶法。在20 世紀(jì)80 年代隨著流體靜力學(xué)平衡系統(tǒng)（HSES）和流體動(dòng)力學(xué)平衡系統(tǒng)（HDES）的提出而取得了很大的突破[3]。在HDES 基礎(chǔ)上，Conway W D 等在實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)單側(cè)HDES 現(xiàn)象[3-4]。高效逆流色譜儀的出現(xiàn)得益于單側(cè)HDES 現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)[5]。1994 年Ito 博士提出了新的CCC 技術(shù)，pH 區(qū)帶逆流色譜和離子對(duì)逆流色譜[6]，使逆流色譜技術(shù)有了長(zhǎng)足發(fā)展。

高速逆流色譜不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)，因而避免了不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，更能反映其本來(lái)的特性，適合于天然生物活性成分的分離，而且由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備效率大大提高，是一種理想的制備分離手段。逆流色譜應(yīng)用于手性化合物的分離，不需要采用化學(xué)手段將手性試劑鍵合到固體介質(zhì)上，同一根逆流色譜分離柱可以反復(fù)多次地用于不同手性化合物的分離，只需選擇合適的兩相溶劑體系和手性試劑即可，在拆分外消旋體時(shí)避免了不可逆吸附引起的溶液和昂貴樣品的損失。相對(duì)于傳統(tǒng)的色譜拆分手段，高速逆流色譜具有適用范圍廣[7]、操作靈活、高效、快速、制備量大、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。

1 逆流色譜手性分離原理

由于逆流色譜技術(shù)與一般液相色譜的主要區(qū)別是不用填料作為固定相，這與普通HPLC 相比是完全不一樣的：手性試劑不需要涂敷或鍵合到固體填料上，因此手性識(shí)別機(jī)理存在一定差異。

目前，色譜法分離外消旋體一般采用兩種形式：直接法和間接法。間接法是使對(duì)映異構(gòu)體先與一種光學(xué)純的試劑反應(yīng)，生成非對(duì)映異構(gòu)體，然后在非手性的環(huán)境下進(jìn)行分離；直接法即采用手性固定相或手性添加劑直接對(duì)異構(gòu)體進(jìn)行分離和測(cè)定。直接法因簡(jiǎn)便、快捷而在色譜分離手性藥物上面應(yīng)用更廣泛[8]。

逆流色譜拆分消旋體一般采用的是直接法，即在逆流色譜的固定相或者流動(dòng)相中分別添加手性試劑（疏水性和親水性手性試劑的結(jié)合）來(lái)實(shí)現(xiàn)手性化合物的拆分和分離，主要分為單相識(shí)別模式和雙相識(shí)別（固定相Stationary phase/流動(dòng)相Mobile phase Recognition，簡(jiǎn) 稱S/M 識(shí) 別）模式。手性選擇劑和對(duì)映體之間通過(guò)氫鍵、偶極-偶極、π-π、疏水作用和空間作用等結(jié)合，從而在兩相間的分配系數(shù)不同（親和力不同），達(dá)到分離手性藥物的目的。

1.1 單相識(shí)別模式

單相識(shí)別：即僅僅在固定相中添加手性試劑或僅僅是手性流動(dòng)相添加劑法，但事實(shí)上由于CCC 分離柱的理論塔板遠(yuǎn)小于HPLC 分離柱，單一的在固定相或在流動(dòng)相中添加手性試劑的方法對(duì)于CCC 來(lái)說(shuō)很難取得良好的分離效果。

以有機(jī)固定相中添加手性試劑為例，高速逆流色譜手性分離單相識(shí)別原理如圖1 所示：

圖1 高速逆流色譜手性分離單相識(shí)別原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of chemodynamic equilibrium between the racemates（A±）and chiral selector（CS）in the separation column based on monophasic recognition

從圖1 中可以看出，在固定相中對(duì)映體（A+和A-），手性選擇劑（CS）與它們的結(jié)合物（CSA+和CSA-）保持動(dòng)態(tài)平衡。同時(shí)對(duì)映體（A+和A-）各自在固定相和流動(dòng)相中保持平衡?？梢缘玫较铝斜磉_(dá)式：

其中，A+—表示右旋體；A-—表示左旋體；A+，-—表示外消旋體；D+—表示A+在有手性添加劑的情況下的分配系數(shù)；D-—表示A-在有手性添加劑的情況下的分配系數(shù)；D0—表示A+，-在沒有手性添加劑的情況下的分配系數(shù)；Kf+—表示在化學(xué)計(jì)量比為1∶1 情況下結(jié)合物CSA+的形成常數(shù)；Kf-—表示在化學(xué)計(jì)量比為1∶1 情況下結(jié)合物CSA-的形成常數(shù)。

從上述表達(dá)式可以得到：

則對(duì)映體的分離因子α：

式（8）表明對(duì)映體的分離因子α 隨著手性選擇劑的濃度（[CS]）和Kf+／Kf-比值的增加而增加。由于與手性添加劑（CS）結(jié)合能力的不同，左旋體和右旋體在兩相體系中分配系數(shù)的差異引起分離因子變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)映體分離。

事實(shí)上，由于CCC 分離柱的理論塔板遠(yuǎn)小于HPLC 分離柱，單一的在固定相或在流動(dòng)相中添加手性試劑的方法對(duì)于CCC 來(lái)說(shuō)很難取得良好的分離效果。

1.2 雙相識(shí)別模式

雙相識(shí)別：即在逆流色譜的固定相和流動(dòng)相中分別添加不同的手性試劑來(lái)研究手性化合物的分離。HSCCC 雙相識(shí)別原理如圖2 所示：

圖2 雙相識(shí)別逆流色譜原理圖Fig.2 Schematic diagram of chemodynamic equilibrium between the racemates（A±）and chiral selector（CS）in the separation column based on biphasic recognition.

從圖2 中可以看出，對(duì)映體（A+和A-），兩種不同手性選擇劑（[CS]org和[CS]aq）與它們的結(jié)合物（[CSA+]org、[CSA-]org和[CSA+]aq、[CSA-]aq）分別在固定相和流動(dòng)相中保持動(dòng)態(tài)平衡。同時(shí)對(duì)映體（A+和A-）各自在固定相和流動(dòng)相中保持平衡。

相比于單相識(shí)別模式，雙相識(shí)別模式中，對(duì)映體的分配系數(shù)表示如下：

對(duì)映體的分離因子α：

Kf+—表示在化學(xué)計(jì)量比為1∶1 情況下結(jié)合物[CSA+]org在有機(jī)相中的形成常數(shù)；Kf-—表示在化學(xué)計(jì)量比為1∶1 情況下結(jié)合物[CSA-]org在有機(jī)相中的形成常數(shù)；K′f+—表示在化學(xué)計(jì)量比為1∶1 情況下結(jié)合物[CSA+]aq在水相中的形成常數(shù)；K′f-—表示在化學(xué)計(jì)量比為1∶1 情況下結(jié)合物[CSA-]aq在水相中的形成常數(shù)。

在流動(dòng)相中添加手性選擇劑，通過(guò)流動(dòng)相手性選擇劑的輔助識(shí)別能力，在表觀上增大了固定相手性選擇劑對(duì)對(duì)映體的選擇性，使得分離選擇性系數(shù)增大。流動(dòng)相中添加的手性選擇劑與對(duì)映體產(chǎn)生一種競(jìng)爭(zhēng)吸附，能夠顯著改變外消旋體不同對(duì)映體與固定相手性選擇劑之間的分子間作用力，最終導(dǎo)致分離度增加。在雙相識(shí)別體系中，對(duì)映體的分離因子α 和親水性手性選擇劑的濃度（[CS]aq）、親脂性手性選擇劑的濃度（[CS]org）和Kf+／Kf-比值以及K′f+／K′f-比值有很大關(guān)系，隨著這些因素增加而增加。所以添加合適的手性選擇劑和選擇合適的兩相溶劑系統(tǒng)，對(duì)于成功分離外消旋體十分重要。

2 逆流色譜手性系統(tǒng)的選擇

2.1 兩相溶劑系統(tǒng)的選擇

溶劑體系的選擇對(duì)于HSCCC 十分重要，兩相溶劑應(yīng)該滿足以下要求[9]：（1）為了保證必要的固定相保留值（體積比不小于50%），溶劑體系的分層時(shí)間應(yīng)小于30 s；（2）目標(biāo)樣品的分配系數(shù)K若接近于1，容量因子應(yīng)大于1.5；（3）盡量采用揮發(fā)性溶劑，以方便后續(xù)處理及易于物質(zhì)的純化；（4）不造成樣品的分解或變性，且對(duì)樣品有足夠高的溶解度。

目前用的最多和比較適合的是兩種溶劑系統(tǒng)：正己烷/乙酸乙酯/正丁醇/甲醇/水，氯仿/甲醇/水。對(duì)于一種未知的樣品，Ito 認(rèn)為可以選擇一種應(yīng)用較為成熟的溶劑系統(tǒng)，例如先采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（1∶1∶1∶1）或氯仿/甲醇/水（10∶3∶7）進(jìn)行嘗試，再根據(jù)目標(biāo)組分的分配系數(shù)調(diào)整溶劑的組成[10]。如果需要親水性更強(qiáng)的體系，加入鹽（醋酸銨）或酸（三氟醋酸或醋酸）。還有人提出正丁醇/乙酸乙酯/水（3∶2∶5）適用于分離極性大的物質(zhì)，而正庚醇/乙酸乙酯/甲醇/水（6∶1∶6∶1）適用于弱極性和非極性體系[11]。

常用溶劑體系的選擇首先根據(jù)樣品的理化特性選出最佳溶劑，再選擇相應(yīng)的數(shù)種溶劑，以組成選擇性最好的多元溶劑體系[12]。

2.2 添加手性選擇劑

在添加手性選擇劑時(shí)，手性選擇劑應(yīng)滿足以下要求：①能夠完全溶解在溶劑中或混合溶劑中；②在液相溶劑中能夠保持對(duì)對(duì)映體的識(shí)別能力。一般地，手性選擇劑加入由有機(jī)溶劑或混合溶劑組成親脂固定相中，親水性溶劑或水溶液作為流動(dòng)相。

篩選合適手性選擇劑方法：（1）從手性試劑的萃取拆分研究以及借鑒氣、液、毛細(xì)管電泳中廣泛使用的手性添加劑，找到適合于逆流色譜的手性添加劑，是一個(gè)很好的途徑，這類手性選擇劑有離子對(duì)試劑、配體交換試劑、蛋白質(zhì)親和試劑、環(huán)糊精及冠醚包合試劑和手性氫鍵作用試劑等。如環(huán)糊精及其衍生物，冠醚包合試劑已經(jīng)用在分離撲爾敏、氨魯米特等手性藥物逆流色譜中。（2）按照交互作用原理選擇手性選擇劑：如果化合物A 的對(duì)映體之一能夠拆分化合物B 的對(duì)映體，則化合物B 的單一對(duì)映體能夠拆分A 的對(duì)映體。目前人們嘗試以大環(huán)分子類的環(huán)糊精及其衍生物、冠醚及其衍生物，天然多糖衍生物，蛋白質(zhì)和氨基酸作為手性選擇劑，在拆分消旋體方面取得了成功。其中CCC 手性分離中應(yīng)用比較成功的手性選擇劑主要有三類：L-脯氨酸衍生物、磺化β-環(huán)糊精類和大環(huán)抗生素（萬(wàn)古霉素）類。

2.2.1 以大環(huán)分子作為手性選擇劑

2.2.1.1 環(huán)糊精及其衍生物

組成環(huán)糊精的每個(gè)葡萄糖單元有5 個(gè)手性碳原子，因而作為主體分子，能夠提供客體分子一個(gè)良好的不對(duì)稱環(huán)境，由于獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，環(huán)糊精能選擇性地包結(jié)多種客體分子，形成具有不同自由能的包結(jié)物。作為手性選擇劑，客體分子的作用行為將呈現(xiàn)差別，若客體分子是一對(duì)對(duì)映體，則將形成非對(duì)映體的包結(jié)物，呈現(xiàn)對(duì)映體選擇性，這是環(huán)糊精拆分對(duì)映體的主要依據(jù)。

環(huán)糊精取代基的位置及引入基團(tuán)的性質(zhì)將深刻影響改性后的環(huán)糊精的各種性狀，成為影響其手性選擇性的主要因素[13]。研究結(jié)果表明，如果分子中的手性中心與伯氨基鄰近，可獲得最佳的分離效果[14]。環(huán)糊精外部羥基衍生化，羥基被羧甲基、甲基等基團(tuán)取代，取代基具有雙重作用，在空間上擴(kuò)大或縮小環(huán)糊精手性腔的大小，改變包結(jié)作用能力；同時(shí)，由于引入新的基團(tuán)可發(fā)生p-p相互作用，氫鍵和偶極疊合的功能，因此，增加新的拆分作用點(diǎn)，兩者均導(dǎo)致選擇性的顯著變化?；瘜W(xué)修飾環(huán)糊精可改變天然環(huán)糊精的理化性質(zhì)，改變手性選擇性，環(huán)糊精衍生物分離手性物質(zhì)的成功在HPLC，CE 和GC 有過(guò)很多報(bào)道[15-17]。

Breinholt J 等[18]采用硫酸化的β-環(huán)糊精作為選擇劑去分離7-去甲基-奧美昔芬。首次介紹了環(huán)糊精衍生物作為手性選擇劑成功應(yīng)用于逆流色譜分離外消旋體。

劉佳川[19]嘗試在高速逆流色譜中以環(huán)糊精及其衍生物作為手性選擇劑，對(duì)15 種藥物進(jìn)行篩選拆分，發(fā)現(xiàn)水溶性的羧甲基β-環(huán)糊精能夠拆分手性藥物氨魯米特和撲爾敏，并建立了制備性分離氨魯米特的分離方法。溶劑系統(tǒng)選擇乙酸乙酯/甲醇/水的比例為10∶1∶9 或10∶2∶8 對(duì)氨魯米特能拆分，且比例為10∶1∶9 拆分效果比較好。

Ai P 等[20]選擇20 mmol/L 羧基羧甲酯-β-環(huán)糊精作為手性選擇劑添加到流動(dòng)相中，用乙酸乙酯：甲醇：水=10∶1∶9 作為兩相溶劑系統(tǒng)，分離1.2 h，消旋體能得到有效的分離。

Tong S Q 等[21]作了高速逆流色譜雙相識(shí)別模式分離α-環(huán)己基扁桃酸外消旋體的研究。兩相溶劑系統(tǒng)選擇正己烷/甲基叔丁基醚/磷酸鹽溶液（9∶1∶10），添加0.3 mol/L（-）-2-乙基己基酒石酸鹽在有機(jī)固定相中，添加0.1 mol/L 羥丙基-β-環(huán)糊精于流動(dòng)相中，在溫度為8 ℃，流動(dòng)相pH=2.68，樣品在帶260 mL 柱容積的CCC 制備儀中最大量為440 mg，在這種分離條件下，分離效果最好。分離物的純度可以達(dá)到99.5%以上。除掉CS 得到目標(biāo)化合物，可以達(dá)到85%～88%。最終右旋對(duì)映體得到186 mg，左旋對(duì)映體得到190 mg。

2.2.1.2 冠醚及其衍生物

冠醚的結(jié)構(gòu)是一種有親水性的內(nèi)腔和疏水性的外殼，一般是引入一些手性單元作為手性選擇劑。目前常用的是18-冠-6-醚類，它主要用于分離一級(jí)胺，尤其是氨基酸及其衍生物的分離（醚環(huán)上的氧原子和氮原子上的氫原子形成氫鍵，4 個(gè)手性碳上的羧基向兩側(cè)交叉對(duì)應(yīng)形成位阻，靜電作用和位阻作用使對(duì)映體與冠醚形成有差異的主客體）。但一級(jí)胺必須質(zhì)子化方能達(dá)到分離，因此流動(dòng)相必須是酸性的。

Kim E 等[22]研究應(yīng)用（+）-（18-冠-6）-四甲酸作為手性選擇劑，分離吉米沙星對(duì)映體。溶劑的疏水性增加，吉米沙星單一對(duì)映體的分離度相應(yīng)的增加。所以選擇了1-BuOH∕EtOAc/20 mol/L雙三羥基甲氨基醋酸鹽緩沖液，比較適合。較高的pH 與吉米沙星有很強(qiáng)的相互作用，也能使冠醚去質(zhì)子化。選擇最優(yōu)的溶劑的pH，以及合適選擇劑含量，也能提高其分離度。在pH 為6 時(shí)，吉米沙星單一對(duì)映體的分離度最高，比應(yīng)用毛細(xì)管電泳（最適宜pH 為4.5）時(shí)還要好。

冠醚的優(yōu)點(diǎn)為在一定條件下能夠?qū)Σ奉悓?duì)映體快速直接分離，無(wú)需衍生化。但冠醚的分離能力受濃度的影響大，且毒性較大，柱效相對(duì)較低，其應(yīng)用受到一些限制。

2.2.2 以天然的多糖衍生物作為手性添加劑

這類物質(zhì)以糖苷鍵相連，具有螺旋結(jié)構(gòu)和溝槽，從而有吸附和包結(jié)的作用，并且容易獲取。衍生化能夠提供各種作用位點(diǎn)，容量大適合制備型色譜。目前一般是引入3，5-二硝基取代基。

Perez E 等[23]應(yīng)用纖維素和直鏈淀粉的苯基酰胺（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）衍生物作為逆流色譜的手性選擇劑，采用傳統(tǒng)洗脫方式和pH區(qū)帶逆流色譜，嘗試用幾種有機(jī)/水兩相溶劑系統(tǒng)分離8 種分別顯酸性、中性和堿性的目標(biāo)樣品。最后發(fā)現(xiàn)在甲基異丁基酮（MIBK）/水溶液或甲基叔丁基醚（MTBE）/水溶液兩相體系下，對(duì)心得靜（一種血管舒張藥）和殺鼠靈兩種藥物分離較為理想。心得靜在兩相體系為甲基異丁基酮（MIBK）/水溶液，固定相為10 mol/L 二乙醇胺（DEA）以及7.5 mg/mL 纖維素衍生物，流動(dòng)相為H2O（HCl 5 mol/L）的情況下，右旋對(duì)映體的純度可以達(dá)到92%，左旋對(duì)映體的純度可以達(dá)到85%。殺鼠靈在兩相體系為甲基叔丁基醚（MTBE）/水溶液兩相體系下，固定相10 mol/L 三氟乙酸（TFA）以及7.6 mg/mL 直鏈淀粉衍生物，流動(dòng)相為H2O（2.5 mol/L NH4OH）的情況下，右旋對(duì)映體的純度可以達(dá)到89%，左旋對(duì)映體的純度可以達(dá)到97%。可以發(fā)現(xiàn)在最好的分離條件下，兩種藥物的分離度都能夠達(dá)到84%～97%。

Perez E 等[24]也作了關(guān)于使用纖維素的衍生物作為手性選擇劑應(yīng)用于逆流色譜的研究，經(jīng)過(guò)化學(xué)改性，纖維素作為手性選擇劑分離外消旋體有很好的效果，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用。目前多糖類衍生物作為手性選擇劑時(shí)手性識(shí)別能力較強(qiáng)，方法也較為成熟。

2.2.3 蛋白質(zhì)和氨基酸

目前用的較多的是L-脯氨酸衍生物，一般是至少引入一個(gè)3，5-二取代基芳香環(huán)，包括有硝基、氯代或甲基基團(tuán)[25]。蛋白質(zhì)和對(duì)映體的作用主要為疏水和靜電作用。

Delgado B 等[26]通過(guò)比較N-十二烷?；?L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺及其衍生物作為選擇劑時(shí)分離消旋體結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在其結(jié)構(gòu)中引入一個(gè)π電子供應(yīng)基團(tuán)，對(duì)其手性選擇有積極作用，但是這些改性可能降低其在親脂性溶劑中的溶解度，可能限制制備目的的適用性。L-脯氨酸衍生物作為手性選擇劑，有更強(qiáng)的手性選擇性。醋酸銨緩沖液保留時(shí)間較磷酸鹽緩沖液大，酸化溶劑體系，能夠使N-二硝基苯-L-亮氨酸在有機(jī)固定相中的分離度更高，從而增加被分析物的保留和分離。

Ma Y 等[27]研究應(yīng)用高速逆流色譜以L-脯氨酸的衍生物N-十二烷?；?L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺作為手性選擇劑對(duì)（±）-二硝基苯氨基酸消旋體進(jìn)行拆分。通過(guò)比較常規(guī)和pH 區(qū)帶逆流色譜兩種拆分技術(shù)分離外消旋體的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用pH 區(qū)帶逆流色譜分離消旋體的效果較好。使用常規(guī)技術(shù)，在2～9 h 的時(shí)間內(nèi)，10 mg 到最多1 g的樣品能夠得到分離；而pH 區(qū)帶色譜中，在少于3 h 的時(shí)間內(nèi)，超過(guò)2 g 的樣品得到了有效地分離。

Ma Y[28]用高速逆流色譜進(jìn)行制備規(guī)模的分離手性化合物獲得了成功，并且申請(qǐng)了專利。在這項(xiàng)研究中，使用了帶有325 mL 容量柱的多層線圈行星離心儀，以N-（3，5-introbenzoyl）-D，Lamino acids 為樣品，N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺作為手性選擇劑，溶劑系統(tǒng)選擇正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水，對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行了拆分。第二種操作采用pH 區(qū)帶逆流色譜，兩種異構(gòu)體的特征矩形峰的重疊小于5%。

Pérez A M[29]做了關(guān)于氟化的手性選擇劑L-脯氨酸的衍生物在逆流色譜分離旋光對(duì)映體中應(yīng)用的研究。在這項(xiàng)研究中，描述了在CCC 中應(yīng)用良好、在室溫下十分穩(wěn)定的溶劑系統(tǒng)，即一種氟化的溶劑乙氧基諾娜氟丁烷（ENFB），發(fā)現(xiàn)ENFB/2-PrOH/H2O（25∶35∶40）混合液較為適合分離DNB-Leu 和DNB-Leu-tBu。該研究表明，這種氟化的手性選擇劑在分離非電離手性化合物方面具有應(yīng)用前景，開發(fā)了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。

蛋白類作為手性選擇劑在CCC 手性分離外消旋體中應(yīng)用廣泛，拆分效果也較好。但蛋白質(zhì)只能與具有特定幾何構(gòu)型和化學(xué)官能團(tuán)的分子結(jié)合，拆分一些特定的消旋體。

2.2.4 其他

Rubio N 等[30]研究用（S）-萘普生衍生物（S）-N，N-二乙基胺萘普生作為手性選擇劑，運(yùn)用多重雙模逆流色譜進(jìn)行手性分離（±）-N-（3，4-順-癸基-1，2，3，4-四氫化菲-4-）-3，5-二硝基苯酰胺和N-（3，5-二硝基苯甲酰）-（±）-亮氨酸。

Franco P 等[31]研究用金雞納屬生物堿衍生物作為逆流色譜手性選擇劑分離N-氨基酸衍生物和2-芳氧基丙酸，并找到了合適的手性系統(tǒng)。醋酸銨緩沖液/叔戊醇/甲醇/庚烷，特別是醋酸銨緩沖液/甲基異丁基醚或二異丙基醚非常適合對(duì)消旋體進(jìn)行分離。

3 展望

逆流色譜作為一種不用固態(tài)載體能實(shí)現(xiàn)連續(xù)有效分離的色譜技術(shù)，在手性藥物的分離分析方面有很大的應(yīng)用前景。手性分離技術(shù)已經(jīng)在高壓液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和毛細(xì)管電泳（CE）中得到廣泛應(yīng)用，但在逆流色譜中應(yīng)用很少。與其它色譜新技術(shù)相比，逆流色譜存在一些不足，在拆分外消旋體方面還有待于普及和推廣。隨著逆流技術(shù)的迅猛發(fā)展，逆流色譜在手性分離中的應(yīng)用會(huì)日趨成熟。目前主要困難在于選擇適合的手性添加劑，近年來(lái)人們選用一些常用的手性選擇劑去分離手性藥物，例如冠醚被用來(lái)分離含有氨基的一類藥物，一些源自HPLC 技術(shù)的手性選擇劑如N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺和β-環(huán)糊精等，應(yīng)用到逆流色譜分離外消旋體中也取得很好的效果。在這些手性選擇劑中，L-脯氨酸類和環(huán)糊精類在逆流色譜分離外消旋體的應(yīng)用方面比較廣泛，技術(shù)相對(duì)成熟，且這兩類成分為天然物質(zhì)，低毒，價(jià)格低廉，是未來(lái)逆流色譜手性選擇劑發(fā)展方向。相信隨著研究的深入，逆流色譜會(huì)在外消旋體分離分析方面有著更加廣泛的應(yīng)用前景。主要通過(guò)手性系統(tǒng)的研究開發(fā)，不斷發(fā)現(xiàn)新的手性選擇劑和溶劑系統(tǒng)，提高分離效率。同時(shí)也應(yīng)做深入的基礎(chǔ)性研究，為逆流色譜手性分離技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)。