禁食時間對昆明小鼠糖耐受和胰島素分泌的影響

湯 琦，施 磊，鄭 璐，代琴芳，陳小川

(西南大學動物科技學院，重慶 400715)

口服葡萄糖耐受實驗(oral glucose tolerance test,OGTT)是目前評價機體糖代謝狀態(tài)的標準之一，同時也是評價機體胰島β細胞功能的常用方法[1]。為了使胃充分排空，其中比較關(guān)鍵的一步是禁食，但過長或過短時間禁食對機體存在潛在的影響，使得實驗動物的生理狀態(tài)出現(xiàn)差別[2-3]。實驗動物禁食時間過長會產(chǎn)生強烈的饑餓感，影響正常的糖代謝，胰島素敏感性下降，出現(xiàn)胰島素抵抗，在OGTT中更容易出現(xiàn)高血糖現(xiàn)象[4]；禁食時間過短，胃內(nèi)容物對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響。因此，值得進一步研究和探討實驗動物在OGTT中最佳禁食時間。大鼠的糖耐受實驗禁食時間有較系統(tǒng)的研究，為10～12 h，在小鼠的諸多糖耐量實驗中，禁食時間并不統(tǒng)一。有人選擇4、6、8 h作為禁食[5]，但大部分普遍選擇10～12 h為禁食時間[6-10]，最長禁食時間也有14～16 h[11-12]；國外對雄性C57BL/6J小鼠有較系統(tǒng)的研究，選擇禁食0、3、6、24 h，在OGTT中禁食6 h是評估糖耐受的最佳方法[13]。但6～24 h之間跨度較大，實驗結(jié)果差異大、分辨率不高，實驗條件也不統(tǒng)一，沒有很強的說服力。所以有必要在小鼠的品種、性別、年齡、體重、胰島素抵抗、實驗環(huán)境等多種影響因素同一的條件下對小鼠OGTT進行系統(tǒng)、詳細的研究，可以更好地優(yōu)化OGTT禁食方案。

小鼠具有各種不同基因背景的近交品系、突變品系和封閉群，為研究提供了多種動物模型選擇。已有許多文獻表明不同基因背景小鼠的糖代謝、脂代謝能力都有明顯差異[14-16]，因此選擇合適的品系作為研究對象就顯得十分重要。糖尿病模型大部分是采用 C57BL/6J小鼠[17]，但現(xiàn)有的糖尿病模型新進展顯示，C57BL/6J品系小鼠可能并不是糖尿病模型的理想動物[18]，該品系小鼠對實驗環(huán)境要求較高，成模率、死亡率和昆明小鼠基本一致[19]，因此昆明小鼠是較C57BL/6J小鼠更為經(jīng)濟有效的建立糖尿病模型的小鼠品系[19]。C57BL/6J小鼠在OGTT中的禁食時間國外有較為系統(tǒng)的研究，但昆明小鼠沒有比較系統(tǒng)的研究。昆明小鼠是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠交群小鼠，它在我國生物醫(yī)學動物實驗中約為小鼠總用量的70%[20]。因此，研究人員參考了國外C57小鼠的案例，在昆明鼠上進行進一步研究和探討。

一些研究表明，性別差異會影響體重、葡萄糖耐受、空腹血糖和胰島素水平[21- 22]，40日齡雄性昆明小鼠的血糖和胰島素水平上升更為顯著，生化結(jié)果穩(wěn)定可靠[23-24]。因此，本實驗采用四組6～7周齡的雄性昆明小鼠，通過分別禁食4、8、10、12 h，利用OGTT比較每組昆明小鼠血糖濃度、胰島素濃度、空腹血糖濃度值與胰島素濃度值比值的差異，分析不同禁食時間后昆明小鼠血糖濃度和胰島素濃度的變化。初步探討禁食時間對昆明小鼠糖耐量和葡萄糖刺激胰島素分泌的影響，探尋比較合理的禁食時間。為昆明小鼠進行OGTT時提供科學的禁食時間的參考，也可在采用昆明小鼠建立糖尿病模型時，糖耐量實驗的禁食時間提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5～6周齡清潔級昆明雄性小鼠16只，體重31～34 g，由重慶市中藥研究所提供[SCXK(渝) 2012-0006]，飼養(yǎng)在國家級動物科學實驗教學示范中心[SYXK(渝) 2012- 0003]。小鼠每四只飼養(yǎng)于籠中(30 cm × 15 cm × 20 cm)，適應性飼養(yǎng)2周，飼以標準鼠料(重慶市中藥所，重慶)，自由進食和飲水。室內(nèi)溫度為(28 ± 1)℃，光照16 L∶8 D，濕度為40% ～ 60%。實驗當天小鼠隨機分為 4 組，每組4只，然后分別禁食4、8、10、12 h，禁食時去除籠中的墊料和鼠料，只留充足的飲水。動物使用的倫理審批號(IACUC)為No. [2007] 3，實驗過程按照實驗動物的使用3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖(上海生工生物工程公司)，血糖試紙(美國Roche公司)，超敏小鼠胰島素酶免試劑盒(易致生物科技有限公司)，血糖儀(羅氏，美國)，冷凍離心機(Eppendorf AG，德國)，酶標儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠口服葡萄糖耐量實驗

禁食后，稱取小鼠體重，然后將小鼠固定于固定器上，再斷尾處理(約2 mm)。棄去兩滴血后，采用血糖儀檢測血糖濃度；緊接著使用抗凝血槍頭(肝素鈉處理)的移液槍尾尖采血70 ～ 100 μL。將上述采集的血樣用離心機在4℃、3000 r/min條件下離心20 min，然后將血漿移至另一滅菌離心管中，放置冷凍盒上，以備隨后胰島素檢測。之后葡萄糖按1.5 mg/g灌胃(8號灌胃針)，每只小鼠應當灌胃的葡萄糖體積(μL)=10 × 小鼠體重(g)，灌胃后立即記為0 min。隨后的15、30、60、90 min測血糖濃度并尾尖采血。

1.3.2 小鼠血漿胰島素濃度測定

將上述采集的血樣用超敏小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測胰島素濃度。先用標準品稀釋液稀釋倍比標準品，接著加樣、封板、37℃溫育30 min；隨后配洗滌液，洗板后加酶標試劑，37℃溫育30 min；然后洗板后加入顯色劑，37℃避光顯色15 min；最后加入終止液，在15 min內(nèi)使用酶標儀450 nm波長讀出OD值。試劑盒批間和批內(nèi)檢測精密度變異系數(shù)均小于10%。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重

禁食完成后，稱量昆明小鼠體重，總體平均體重在(33.97 ± 2.61)g之間，各組小鼠體重沒有差異，見表1。

2.2 不同禁食時間對小鼠血糖的影響

小鼠禁食后，隨著禁食時間的延長，各組小鼠空腹血糖值逐漸降低，禁食8、10、12 h組小鼠空腹血糖分別低于禁食4 h組小鼠空腹血糖40%、56%、79%(P< 0.01)(圖1A)。葡萄糖灌胃后，每組小鼠血糖立即升高，15 min時禁食4 h小鼠血糖比禁食10 h小鼠高5%，比禁食8、12 h小鼠血糖均高23%。30 min時各組小鼠血糖值均達到最高點，禁食12 h小鼠血糖低于其他三組15%左右；與0 min相比，30 min時禁食4、8、10、12 h小鼠血糖升高61%、73%、75%、74%，禁食10 h血糖上升幅度最大。30 min后血糖逐漸下降，90 min時各組小鼠血糖值均恢復到初始水平，各組小鼠血糖無差異(圖1B)。通過曲線下面積分析，禁食10 h小鼠血糖曲線下面積最大，比禁食4 h小鼠血糖曲線下面積高31%(P< 0.05)，比禁食8、12 h小鼠分別高16%、17%(圖1 C)。

2.3 不同禁食時間對小鼠胰島素的影響

隨著禁食時間的延長，各組小鼠空腹胰島素都逐漸降低，禁食4 h的空腹胰島素比禁食8 h高4%，大約是禁食12 h空腹胰島素的兩倍(圖2A)。在灌胃之后，小鼠胰島素含量立即升高，在15 min采血點上其含量最高，禁食4 h組的15 min胰島素比0 min胰島素高66%，比禁食8、10、12 h小鼠分別高60%、67%、71%。隨后胰島素下降迅速，大約在60 min降至基準值，禁食10 h小鼠下降幅度最大，比15 min最高點下降了65%；禁食12 h小鼠下降幅度最小，為46%(圖2B)。禁食4 h組的胰島素曲線下面積比其他三組分別高30%、34%、31%(圖2C)。

2.4 不同禁食時間的空腹血糖與胰島素比值

空腹血糖與血漿胰島素的比值可作為最簡便的胰島素抵抗指標[25]。通過空腹血糖與血漿胰島素的比值分析，昆明小鼠在OGTT前禁食4、8、10、12 h，沒有改變胰島素抵抗，總體平均值無顯著差異。(圖3)。

表1 小鼠體重變化

圖1 不同禁食時間對小鼠血糖的影響Figure 1 Effects of different fasting time on blood glucose in the mice

圖2 不同禁食時間對小鼠胰島素的影響Figure 2 Effects of different fasting time on the insulin in mice

圖3 不同禁食時間的空腹血糖與胰島素比值Figure 3 Fasting blood glucose and insulin ratio with different fasting time

3 討論

糖耐受實驗已成為檢測血糖耐受和胰島素分泌最廣泛應用的生理測試之一，實驗前禁食時間的長短會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響；小鼠作為糖耐受實驗的研究對象，其品種、性別、年齡、體重、禁食時間等諸多因素的不同一，得到的實驗結(jié)果可能會有一定差異。本實驗在同一實驗條件下，針對禁食時間研究發(fā)現(xiàn)，昆明小鼠在OGTT中禁食8～10 h是比較合理的禁食范圍，糖耐受血糖變化差異大，胰島素分泌較好，為昆明小鼠進行OGTT時提供科學的禁食時間的參考。

大量的研究表明外周組織會使胰島素敏感性下降，使外周攝取葡萄糖降低，導致胰島素抵抗[26]。在本實驗中，昆明小鼠的體重為(33.97 ± 2.61)g，符合同年齡段昆明小鼠正常體重(35.26 ± 2.80)g[27]。禁食4、8、10、12 h后，小鼠各組空腹血糖值與空腹胰島素值的比值無顯著差異，總體平均值無顯著差異，說明禁食后沒有改變昆明小鼠胰島素敏感性，所有小鼠胰島素敏感性都保持一致。因此，本實驗在同一的條件下，只針對禁食時間對昆明小鼠糖耐受的影響進行研究。

禁食會降低體內(nèi)糖原和乳酸含量[25]，對糖代謝產(chǎn)生影響。不同禁食時間對小鼠的空腹血糖調(diào)節(jié)會產(chǎn)生一定影響[13]，禁食8、10、12 h小鼠空腹血糖濃度分別低于禁食4 h小鼠空腹血糖濃度40%、56%、79%，與前人研究結(jié)果一致[28]。禁食時間過長會使小鼠可利用能量減少[25]，導致血糖濃度降低。隨著禁食時間的延長，小鼠血糖濃度下降緩慢，各個禁食時間段的空腹血糖濃度都有一定的浮動，血糖的這種變化主要與小鼠的禁食時間長短有關(guān)，不同的血糖變化趨勢可能表明不同禁食時間對昆明小鼠胰島素的敏感性不同。葡萄糖灌胃后，各組小鼠血糖均升高，30 min時各組小鼠血糖值均達到最高點。與0 min相比，禁食10 h血糖上升75%，上升幅度最大，血糖分辨率高。通過分析血糖曲線下面積發(fā)現(xiàn)，禁食10 h組的血糖曲線下面積最大。

在禁食狀態(tài)下血液中胰島素含量維持在基準水平[29]，禁食8 h小鼠的空腹胰島素濃度比禁食4 h組小鼠低4%，而比禁食10 h組小高40%，大約是禁食12 h空腹胰島素濃度的兩倍。葡萄糖灌胃之后，小鼠胰島素含量立即升高，禁食8 h胰島素濃度上升幅度最小，其他三個禁食組胰島素濃度上升幅度基本一致，昆明小鼠禁食8 h，糖耐量胰島素處于較低水平。從胰島素曲線下面積看，禁食8、10、12 h小鼠胰島素曲線下面積基本一致，比禁食4 h小鼠分別低30%、34%、31%，禁食8 h小鼠的胰島素曲線下面積最小。在整個糖耐受中，禁食8 h小鼠的胰島素濃度和禁食4 h小鼠的胰島素濃度較為一致，但禁食8 h小鼠胰島素濃度曲線下面積低于禁食4 h小鼠。由此來看，禁食8 h左右小鼠胰島素分泌量較少，對血糖調(diào)節(jié)效率高。

綜上所述，本實驗在同一條件下，對四組昆明小鼠分別進行4、8、10、12 h的禁食，通過OGTT分析血糖濃度、胰島素濃度、空腹血糖值與空腹胰島素值的比值發(fā)現(xiàn)，禁食8～10 h的昆明小鼠，葡萄糖刺激后，血糖變化趨勢較好，分辨率高，胰島素分泌量較好，在OGTT中可作為比較合理、有效、可靠的禁食時間。