LncRNA C2-AS1通過DNA錯配修復(fù)相關(guān)通路抑制卵巢癌研究

雷 靜，黃 瑋

(寶雞市婦幼保健院，陜西 寶雞 721000)

卵巢癌是一類發(fā)病于卵巢內(nèi)或卵巢上的惡性腫瘤，在女性生殖器官腫瘤中，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌[1]。由于其發(fā)病較為隱匿，缺乏典型癥狀，難以早期發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致相當(dāng)一部分患者失去了早期治療的機(jī)會[2]，廣泛的盆腔和腹腔轉(zhuǎn)移極大地限制了治療手段，使得其成為了全球范圍內(nèi)女性癌癥死亡的第4位常見原因[3]。有研究證實(shí)，lncRNA在DNA錯配修復(fù)(MMR)過程中也發(fā)揮了效用，同時，lncRNA也被報道與卵巢癌的進(jìn)展有關(guān)[4]。本文通過檢測lncRNA C2-AS1表達(dá)水平，探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2015年1月至2017年12月在寶雞市婦幼保健院手術(shù)切除的卵巢癌標(biāo)本，共23例。其中，19例患者年齡在60周歲以上，4例患者年齡不足60周歲，平均年齡(57.38±8.52)歲；pcTNM腫瘤分期：T1期1例，T2期10例，T3期12例；N0期2例，N1～3期21例；均為M0。所有23例標(biāo)本均為配對的腫瘤及癌旁組織。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批，患者已簽署知情同意書。

1.2 RNA測序

在手術(shù)后1h內(nèi)獲取患者標(biāo)本，在-80℃下轉(zhuǎn)運(yùn)和保存，24h內(nèi)將樣品送至上海市吉凱基因科技有限公司，由該公司進(jìn)行RNA測序及結(jié)果輸出。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)庫

TCGA數(shù)據(jù)庫是一個開放的公共數(shù)據(jù)庫，其內(nèi)含400余例卵巢癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)及預(yù)后數(shù)據(jù)，網(wǎng)址為https:∥cancergenome.nih.gov/。本研究使用其中數(shù)據(jù)后利用R 3.4.0和Prism7進(jìn)行基因相關(guān)性分析及預(yù)后分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Prism 7、R 3.4.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，使用R Studio搭載和運(yùn)行R 3.4.0。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA C2-AS1是卵巢癌中低表達(dá)的lncRNA

通過對23對卵巢癌腫瘤及癌旁組織RNA-seq測序數(shù)據(jù)分析，鑒定出卵巢癌中差異表達(dá)的基因列表，共2 622個，其在染色體上的定位見圖1A。通過對這些基因進(jìn)一步進(jìn)行差異表達(dá)分析，選取signal to noise>0.3、P<0.001為界值鑒定出的腫瘤組織內(nèi)差異表達(dá)的前50位基因，其中，lncRNA C2-AS1排名第四，在腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)趨勢，是前50位差異表達(dá)基因中唯一一個lncRNA。左側(cè)綠色樣本為癌旁組織，右側(cè)紅色樣本為腫瘤組織，見圖1B。

2.2 LncRNA C2-AS1相關(guān)基因富集于DNA錯配修復(fù)通路

通過對2 622個基因進(jìn)行WGCNA富集分析，可見納入分析的卵巢癌組織樣本無離群值，見圖2A。確定軟閾值后分步法構(gòu)建模塊，最終構(gòu)建一個含有12個模塊的差異基因加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模型，不同的模塊使用不同的顏色標(biāo)識，其中，灰色模塊內(nèi)是難以歸類的零散基因，見圖2B。LncRNA C2-AS1被富集于黃色模塊中，對模塊內(nèi)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因被富集于DNA錯配修復(fù)相關(guān)通路，見圖2C。

注：B圖左側(cè)綠色樣本為癌旁組織，右側(cè)紅色樣本為腫瘤組織。

圖1卵巢癌內(nèi)高表達(dá)基因熱點(diǎn)圖

Fig.1 Gene heatmap in ovarian cancer

圖2 LncRNA C2-AS1功能預(yù)測

2.3 LncRNA C2-AS1與DNA錯配修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)密切相關(guān)

選取了DNA錯配修復(fù)相關(guān)基因BRCA1、BRCA2、PD-L1(CD274)、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2進(jìn)行相關(guān)性分析，考慮到樣本量較小難以獲得可靠結(jié)果，使用TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，lncRNA C2-AS1與這些基因都有較好的相關(guān)性，見圖3。

圖3LncRNAC2-AS1與DNA錯配修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)正相關(guān)

Fig.3 LncRNA C2-AS1 was positive correlated with DNA mismatch genes

2.4 低表達(dá)lncRNA C2-AS1導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后較差

上述結(jié)果證明了lncRNA C2-AS1在卵巢癌組織中呈低表達(dá)，并且同DNA錯配修復(fù)關(guān)系密切。選取TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了預(yù)后分析，結(jié)果顯示，低表達(dá)lncRNA C2-AS1導(dǎo)致了較差的卵巢癌預(yù)后，見圖4。

圖4 低表達(dá)lncRNA C2-AS1導(dǎo)致較差的卵巢癌預(yù)后

3 討論

3.1 LncRNA C2-AS1是卵巢癌中的抑癌lncRNA

卵巢癌嚴(yán)重威脅女性的生命健康，但是，其發(fā)生發(fā)展因素目前仍十分模糊，導(dǎo)致其難以得到早期診斷和治療。影響卵巢癌發(fā)病的風(fēng)險因素包括激素水平、遺傳背景、環(huán)境因素和年齡等多種因素。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的長度超過200nt的RNA。既往大量研究顯示，許多非編碼RNA和腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，例如，lncRNA MALAT1通過PI3K-AKT通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移[5]，有研究報道，miRNA-124同卵巢癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[6-7]。同時，某些lncRNA同DNA錯配修復(fù)有關(guān)，例如，lncRNA-XIST通過DNA錯配修復(fù)相關(guān)通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤化療抵抗功能。

本研究利用對23對卵巢癌及癌旁組織的測序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA C2-AS1在卵巢癌中呈明顯低表達(dá)，同時選用TCGA公共數(shù)據(jù)庫對該lncRNA表達(dá)情況不同的患者進(jìn)行了預(yù)后分析，結(jié)果顯示低表達(dá)lncRNA C2-AS1患者預(yù)后明顯較差，結(jié)果支持了該lncRNA可能是卵巢癌中的一種抑制腫瘤進(jìn)展的lncRNA。但是，關(guān)于該lncRNA通過何種方式抑制卵巢癌進(jìn)展尚無相關(guān)報道，因此，我們更進(jìn)一步地進(jìn)行了研究，利用WGCNA方法探索了lncRNA C2-AS1可能參與的通路，得到了一些有趣的結(jié)果。

3.2 LncRNA C2-AS1可能通過DNA錯配修復(fù)相關(guān)通路調(diào)控卵巢癌進(jìn)展

近年研究發(fā)現(xiàn)，DNA錯配修復(fù)相關(guān)基因BRCA1和BRCA2突變的卵巢癌患者預(yù)后明顯較未突變患者差，提示患者的遺傳背景差異對于卵巢癌的預(yù)后和治療靶點(diǎn)的尋找可能具有重要意義[8-9]。同時，有研究報道，DNA錯配修復(fù)(MMR)是基因?qū)用鎸?dǎo)致卵巢癌預(yù)后較差的重要因素，同時，MMR和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10-11]。但是，MMR是一個復(fù)雜的過程，仍未清楚其機(jī)制，目前有一些研究報道了其中的幾種關(guān)鍵基因，包括BRCA1、BRCA2、PD-L1(CD274)、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2等[12-16]。包含但不限于這些基因的共同作用，保證了MMR的正常運(yùn)行，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究對23對腫瘤及癌旁組織測序數(shù)據(jù)進(jìn)行WGCNA后，我們發(fā)現(xiàn)，lncRNA C2-AS1共表達(dá)基因被顯著富集于DNA錯配相關(guān)通路上，以上提到的關(guān)鍵基因基本都囊括在內(nèi)。為了研究lncRNA C2-AS1與這些基因的關(guān)系，我們選用了樣本量較大的TCGA數(shù)據(jù)庫對它們做了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，該lncRNA同這些基因都呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，更進(jìn)一步地提示了lncRNA C2-AS1可能通過影響這些基因的表達(dá)或功能從而參與DNA錯配修復(fù)的過程，影響卵巢癌的進(jìn)展。但是，尚未對該lncRNA及這些基因進(jìn)行功能學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，后期需要跟進(jìn)更多的工作完善及證實(shí)相關(guān)理論。

綜上所述，本研究通過利用高通量二代測序技術(shù)檢測患者腫瘤及癌旁組織內(nèi)的基因表達(dá)情況，篩選卵巢癌中差異表達(dá)的lncRNA，預(yù)測其功能，尋找在MMR過程中發(fā)揮作用的lncRNA并驗(yàn)證其與MMR相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性。本研究首次提出了lncRNA C2-AS1低表達(dá)導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后較差，同時lncRNA C2-AS1與MMR通路及其相關(guān)基因表達(dá)密切關(guān)聯(lián)。本研究為探討卵巢癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論研究結(jié)果，為建立卵巢癌的臨床治療和評估預(yù)后靶點(diǎn)提供了新的思路。