HPLC法同時(shí)測(cè)定逍遙丸中阿魏酸和甘草酸含量探討

田 潔，孫玉坤，尹 祿，唐 哲，王海鵬

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，后經(jīng)中藥現(xiàn)代化的工藝改造而制成的中成藥制劑逍遙丸[1]。功效為調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，疏肝理氣，臨床常用于治療肝氣不舒所致頭昏目眩，食欲不振，月經(jīng)失調(diào)，胸脅滿脹等[2-4]。逍遙丸的主要成分包括當(dāng)歸、白芍、柴胡、薄荷、白術(shù)、茯苓、甘草。市面上與逍遙丸相關(guān)的制劑有逍遙膠囊、濃縮丸、逍遙水丸、逍遙片。2015年版《中國藥典》對(duì)以上劑型的質(zhì)量控制僅規(guī)定檢測(cè)芍藥苷的含量，而對(duì)于其他的化學(xué)成分卻沒有相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[5]。文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道了對(duì)逍遙丸中的主要成分阿魏酸、甘草苷、槲皮素、柴胡皂苷的成分檢測(cè)。中成藥的復(fù)方制劑中往往含有多種復(fù)雜的化學(xué)成分，單一測(cè)定其中一種成分，不能客觀全面地反映藥品質(zhì)量，應(yīng)多種成分同時(shí)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立了HPLC法同時(shí)對(duì)逍遙丸中阿魏酸和甘草酸兩種有效成分含量的測(cè)定方法，為逍遙丸的產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有效的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent1260 Infinity 四元泵系統(tǒng)、Agilent1260紫外檢測(cè)器等購自安捷倫科技有限公司；DP-uw實(shí)驗(yàn)室超純凈水器購自北京亞歐德鵬科技有限公司；YZ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器購自上海越眾儀器設(shè)備有限公司；ES-E110A電子分析天平購自天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海右一儀器有限公司。阿魏酸對(duì)照品(批號(hào):110773-201508)和甘草酸對(duì)照品(批號(hào):1405-86-3)，均從中國藥品生物制品檢定所購得；被測(cè)樣品均為市售的逍遙丸；甲醇和乙腈、色譜純由sigma試劑公司生產(chǎn)；磷酸、分析純購自德州潤昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件選擇 采用Agilent Zorbax XDB-C18 的色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；梯度洗脫液選用的是乙腈和0.05%磷酸水溶液30∶70(v/v)；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長為 278 nm；柱溫設(shè)為35 ℃；每次注入樣品量為10 μl；流動(dòng)相梯度程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品阿魏酸2.71 mg、甘草酸5.53 mg，置于100 ml 的容量瓶中，然后加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得阿魏酸和甘草酸濃度分別為0.0271 mg/ml、0.0553 mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取大約50粒市售逍遙丸(仲景宛西制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z44020869)，于研缽中反復(fù)研磨至細(xì)粉、收集后精密稱取1.0 g粉末置于具塞磨口三角燒瓶中，加入20 ml甲醇溶液搖勻溶解，稱定并記錄重量后，超聲波預(yù)處理20 min，取出三角燒瓶，待降至室溫，再次稱定重量，加入甲醇溶液補(bǔ)充損失的重量，充分振搖后濾過，濾過液減壓干燥，將殘?jiān)鸭?0 ml的容量瓶中，加甲醇搖勻、溶解，并定容至刻度，經(jīng)過微孔濾膜(0.22 μm)濾過，獲得的續(xù)濾液，即為制備的供試品溶液，備用。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 在逍遙丸的配方組成中除去甘草、當(dāng)歸兩味中藥成分，將柴胡、白芍、白術(shù)、茯苓、薄荷，按照5∶5∶5∶5∶1比例經(jīng)煎煮、濾過、干燥等工藝處理，制成逍遙丸陰性樣品，取其適量陰性樣品參照“2.3”項(xiàng)處理方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別取10 μl對(duì)照品、供試品和陰性品三種溶液注入高效液相色譜儀中，應(yīng)用本文給出的色譜條件對(duì)試品進(jìn)行測(cè)定并繪制各自的色譜圖。對(duì)得出的三幅色譜圖進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間處沒有出現(xiàn)對(duì)照品成分吸收峰，說明陰性對(duì)照品溶液無干擾(圖1)。

圖1 逍遙丸HPLC色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下制備的兩種樣品的對(duì)照品溶液各2、4、7、10、15、22 μl，依次注入高效液相色譜儀中，根據(jù)前文給出的色譜條件測(cè)定兩對(duì)照品峰面積值，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得阿魏酸回歸方程：Y=1.537×106X-31851，r=0.9995，其進(jìn)樣量在0.054～0.596 μg與峰面積線性關(guān)系良好；甘草酸回歸方程：Y=29058X+3128，r=0.9993，其進(jìn)樣量在0.110～1.217 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 儀器精密度試驗(yàn) 精密量取10 μl“2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，在上述色譜條件下，分6次連續(xù)注入高效液相色譜儀中，詳細(xì)記錄各自峰面積并計(jì)算RSD值，得阿魏酸的RSD值為0.63%，甘草酸的RSD值為0.88%，表明本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的器材具有良好的精密度。

2.7 試品穩(wěn)定性試驗(yàn) 量取“2.3”項(xiàng)下相同批號(hào)逍遙丸制備的供試品溶液，從0 h起每2 h注入樣品1次，共測(cè)7次，詳細(xì)記錄各自峰面積變化，并根據(jù)峰面積計(jì)算RSD值，求得阿魏酸峰面積RSD值為0.53%，甘草酸峰面積RSD值為1.02%，結(jié)果表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 量取“2.3”項(xiàng)下相同批號(hào)逍遙丸制備的供試品溶液6份，精密量取10 μl溶液在上述色譜條件下依次注入高效液相色譜儀中檢測(cè)。通過計(jì)算得阿魏酸平均質(zhì)量RSD值為1.35%，甘草酸平均質(zhì)量RSD值為1.61%，結(jié)果表明此方法具有良好的重復(fù)性。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)Z44020869)市售逍遙丸制劑，含量明確，置于研缽中研細(xì)混勻，平均分成6等份，每份取約1.0 g，精密稱定，置于容量瓶中，將“2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液各取10 ml分別加入6個(gè)容量瓶中，依照上述供試品溶液制備方法處理，得加樣回收率試品溶液。分別精密量取10 μl溶液依次注入色譜儀中，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算阿魏酸和甘草酸兩種成分的加樣回收率、平均加樣回收率和RSD值(表2)。

表2 逍遙丸中阿魏酸、甘草酸回收率試驗(yàn)表

2.10 樣品的測(cè)定 適量稱取市售逍遙丸樣品6個(gè)批次(仲景宛西制藥股份有限公司)，按上述對(duì)照品溶液制備方法制備樣品供試液，分別精密量取10 μl進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算阿魏酸和甘草酸的含量，見表3。

表3 6個(gè)批次逍遙丸樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

通過查閱文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，在供試品溶液制備中，對(duì)提取溶劑選擇，提取方法與時(shí)間優(yōu)化，以甲醇超聲和甲醇加熱回流的提取方式進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取法的效率高于加熱回流法，料液比也更加經(jīng)濟(jì)。在甲醇超聲提取時(shí)間的考察中，分別選取10、20、30、40 min時(shí)間點(diǎn)，結(jié)果以20 min為最佳，更長時(shí)間不能明顯提高效率，而且浪費(fèi)時(shí)間。

在梯度洗脫液的選擇上，本研究分別考察了甲醇/水、甲醇/磷酸、乙腈/水、乙腈/磷酸四種配比組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)逍遙丸的主要成分洗脫與洗脫液的pH值關(guān)聯(lián)較大，甲醇/水、甲醇/磷酸、乙腈/水均不能達(dá)到較好的洗脫效果，通過進(jìn)一步優(yōu)化，最終選取乙腈/磷酸(0.05%)作為流動(dòng)相，可使逍遙丸中阿魏酸和甘草酸兩種檢測(cè)成分得到良好的分離效果，呈現(xiàn)較好的色譜圖。近年來，已有文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)檢測(cè)逍遙丸中多種成分的研究，在測(cè)定多種成分時(shí)，對(duì)色譜條件的選擇提出了更高要求，每種成分的分離及檢測(cè)條件很難達(dá)到均衡統(tǒng)一，需要設(shè)置多種實(shí)驗(yàn)條件，也就增加了檢測(cè)的復(fù)雜性。

通過各項(xiàng)條件優(yōu)化等措施，筆者建立了一套同時(shí)對(duì)逍遙丸中阿魏酸和甘草酸的含量檢測(cè)方法，此方法雖然檢測(cè)的成分較少，但兩種物質(zhì)的最大吸收值相近，選擇一種檢測(cè)波長就可達(dá)到較好的響應(yīng)值，因此具有操作簡單、靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性良好等優(yōu)點(diǎn)，可為市售逍遙丸的質(zhì)量控制提供相關(guān)依據(jù)。