瑪咖水溶性成分的抗疲勞活性研究

李 婧，孫清瑞，張連富*，2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122）

體力疲勞可以定義為運動導致的無法完成原來所從事的正?；顒踊蚬ぷ髂芰1]。高強度的體力運動會擾亂身體體內平衡、引起肌肉損傷、影響生理功能，從而使身體產(chǎn)生疲勞。長期疲勞屬于一種亞健康狀態(tài)，若不及時緩解疲勞，則會產(chǎn)生生理上或者心理上的疾病。所以借助補充具有抗疲勞功效的保健品和藥品來緩解疲勞狀態(tài)顯得格外重要。由于化學性藥品具有一定的副作用，故對具有抗疲勞作用的天然食物和中藥進行研究尤為重要。近年來，苦蕎麥蛋白、綠茶多糖、姜黃素、人參皂苷-Rb1等物質的抗疲勞活性得到了證實[1-4]?，斂В↙epidium meyeniiWalp.）為十字花科（Brassicaceae）獨行菜屬（Lepidium）一年或兩年生草本植物，原產(chǎn)于秘魯海拔3 500 m以上的安第斯山脈[5]。早在1653年，瑪咖的藥用功能就有所記載[6]。傳統(tǒng)上，瑪咖就被用于增強體力、提高生育力以及改善性功能[7]。自2002年引種到中國以來，瑪咖已經(jīng)在云南和新疆地區(qū)成功種植。傳統(tǒng)上，瑪咖就被用于增強體力和緩解疲勞。近年來的科學研究也證實了瑪咖具有抗疲勞功效。已有報道發(fā)現(xiàn)瑪咖脂提物可以增強運動耐力歸功于其中的瑪咖酰胺[8-9]。芐基芥子油苷（BG）是瑪咖中的一種標志性成分，約占瑪咖總芥子油苷的80%～90%[10]。雖然瑪咖水提物的主要成分瑪咖多糖（MPS）和芐基芥子油苷（BG）的抗疲勞功效已有報道[11-12]，但是對于MPS、BG和瑪咖水提物之間的抗疲勞功效關系以及可能的作用機制的研究仍是空白。作者旨在研究瑪咖水溶性成分MPS和BG的抗疲勞功效，以及對其可能的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

瑪咖干片：新鮮黃瑪咖（云南麗江產(chǎn)）經(jīng)蒸汽滅酶、切片、60℃烘干處理后得到。

甲醇、苯酚、濃硫酸、Na2HPO4、NaH2PO4、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、NaCl、TFA均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

用于液相色譜的甲醇為色譜純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

BLA、BUN、MDA、SOD、LDH 和 LG 測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

紅景天提取物由寶雞方晟生物開發(fā)有限公司提供，紅景天苷含量大于6%。

1.2 主要儀器與設備

Waters 1525型液相色譜，美國Waters公司；Waters2998二極管陣列檢測器，美國Waters公司；HFU-586超低溫冰箱，美國熱電公司；M5酶標儀，美國Molecular Devices公司；UV-2802紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器，常州邁科儀器有限公司；GZXGF101-3-BS-II電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；ZKXFB-1真空干燥箱，金壇市華龍實驗儀器廠；TGL-16D冷凍高速離心機，金壇市華龍實驗儀器廠；FE20 pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RV06ML1-B旋轉蒸發(fā)儀，廣州儀科實驗室技術有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機，德國CHRIST公司。

1.3 灌胃樣品準備

瑪咖水提物：滅酶瑪咖干片磨成粉后，用1∶40（m∶V）的去離子水在80℃下提取2 h。提取液過濾、離心除去濾渣后，冷凍干燥得到黃色固體。水提物中的BG含量按照本實驗室建立的方法[13]測定為11 g/kg，多糖質量分數(shù)根據(jù)苯酚-硫酸法測定為253 g/kg。

芐基芥子油苷：將新鮮瑪咖經(jīng)滅酶、干燥、磨粉后通過70%甲醇提取、酸性氧化鋁柱層析、制備液相分離后得到了BG，經(jīng)LC-MS和NMR確定其純度為98.3%。

瑪咖多糖：將瑪咖干粉用蒸餾水提取、中溫淀粉酶和糖化酶酶解、Sevag法除蛋白、醇沉、DEAE-52纖維素柱層析、透析、冷凍干燥后得到白色固體，測定其多糖質量分數(shù)大于95%。

1.4 試驗動物和分組

160只4周齡昆明小鼠飼養(yǎng)于EVC鼠籠中（每籠5只），提供充足的水和飼料，飼養(yǎng)環(huán)境控制在溫度（22±1）℃、濕度 50%～60%、12 h光照/黑暗。 動物試驗設計和操作流程均已通過試驗動物倫理審核和江南大學實驗動物中心批準。

經(jīng)過1個星期的適應期，稱量小鼠體重，160只小鼠隨機分成8組（每組20只）。第1組：空白對照（生理鹽水）；第2組：MPS高劑量組（劑量100 mg/kg·d）；第 3 組：MPS 低劑量組（劑量 20 mg/kg·d）；第 4 組：BG 高劑量組（劑量 5 mg/kg·d）；第 5 組：BG低劑量組（劑量1 mg/kg·d）；第6組：瑪咖水提物組（劑量 100 mg/kg·d）； 第 7 組：MPS+BG （劑量 25.3 mg/kg·d MPS+1.1 mg/kg·d BG）；第 8 組：陽性對照組（紅景天提取物500 mg/kg·d）。灌胃時間為每天15：00，連續(xù)灌胃30 d。每周對小鼠進行不負重游泳訓練一次，每次10 min，觀察其是否有異?，F(xiàn)象。

1.5 負重游泳試驗

灌胃30 d后，每組各取10只小鼠，稱量每只小鼠體重后進行負重游泳試驗。每只小鼠尾部綁上質量為其體重的7%的鐵絲后，將其放入自制游泳箱中（深度 35 cm，（25±1） ℃）負重游泳，當小鼠力竭時記錄此時的時間，力竭的判定標準是小鼠頭部沉入水面7 s不能上浮。

1.6 小鼠待測組織的采集與制備

將每組剩余的10只小鼠放入游泳箱，讓其不負重游泳90 min，結束后立即將小鼠用乙醚麻醉后，摘眼球取血，脫頸椎處死，解剖后取出肝臟，將肝臟立即放置于-80℃冰箱中待用。待全血凝固后4℃、8 000 r/min離心5 min，取血清儲藏于4℃下待用。

1.7 生化指標檢測

BLA、BUN、MDA、SOD、LDH 和 LG 按照試劑盒說明書的方法測定。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析

所有結果按照平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0軟件進行單重比較和Duncan檢驗方法，以P＜0.05為顯著。用a、b、c等不同的字母表示其存在顯著性差異。

2 結果

2.1 小鼠體重

灌胃前后各小組小鼠的平均質量見圖1。

圖1 灌胃前后各組小鼠的平均質量Fig.1 Body weight of the mice on the 0th and 30th day of the period of gavage

2.2 負重游泳

運動耐力是評價抗疲勞功能的直觀指標，通常利用負重游泳動物模型對其進行評估，小鼠和大鼠均為常用的動物模型。本試驗采用負重游泳小鼠模型，測定其負重游泳力竭時間。如圖2所示，各試驗組和陽性對照組的小鼠負重游泳力竭時間均顯著高于空白組。MPS高劑量組、MPS低劑量組、BG高劑量組、BG低劑量組的力竭時間比空白組分別增加了140%、63%、121%和62%。MPS高劑量組的力竭時間顯著高于MPS低劑量組，這說明MPS對小鼠負重游泳力竭時間有顯著的劑量效應，同樣地，BG也有明顯的劑量效應。各試驗組的游泳時間與陽性對照組相比，MPS高劑量組與陽性對照組相比無顯著性差異，其余組均顯著低于陽性對照組。水提物組和MPS+BG組的游泳時間沒有顯著性差異。結果表明：各試驗組均能增強負重游泳小鼠的運動耐力，其中MPS高劑量組效果最好，與陽性對照組效果相當。

圖2 各灌胃劑量對小鼠負重游泳力竭時間的影響Fig.2 Effects of different supplementation on forced swimming test in mice

2.3 生化指標

體力疲勞主要是由有害代謝產(chǎn)物的生成和累積、能量供應不足、氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡紊亂等因素造成的[3]?；趯е缕诘囊蛩?，本節(jié)選擇了BLA、LDH、MDA、SOD、BUN 和 LG 這幾項有關疲勞的代表性指標進行了測定。

2.3.1 血乳酸（BLA） 有害代謝產(chǎn)物的累積是造成疲勞的重要因素之一。BLA是碳水化合物在體內酸性條件下的糖酵解產(chǎn)物，是導致疲勞的代謝產(chǎn)物之一，也是評價疲勞水平的重要指標[14]。乳酸或其對應的pH值在快肌纖維上的變化是導致肌肉損傷的重要因素[15]。過度的乳酸堆積會侵害體內組織，產(chǎn)生疲勞。所以若一種物質可以抑制乳酸堆積和加速乳酸清除率，則可以判定其有抗疲勞功效。如圖3所示，與空白組相比MPS和BG都能顯著降低小鼠的BLA水平，并具有一定的劑量效應。其中BG高劑量組在試驗組中效果最好，其中的BLA含量比空白組降低了34%，跟陽性對照組的效果相比無顯著性差異。水提物組和MPS+BG組的BLA含量無顯著性差異。

圖3 各灌胃劑量對負重游泳小鼠BLA的影響Fig.3 Effects of different supplementation on BLA in mice

2.3.2 乳酸脫氫酶活力 （LDH） LDH可以反映出肌肉的活力，LDH活力影響著乳酸的形成以及乳酸在不同肌肉纖維之間的傳遞[15]。血清中LDH活力的升高表明肌肉已經(jīng)受損或者正在受損[16]，而這些損傷就會降低負重游泳小鼠的運動耐力，直觀體現(xiàn)就在于力竭游泳時間。如圖4所示，各試驗組的LDH活力均顯著低于空白組，其中MPS高劑量組和BG高劑量組相對較低，比空白組分別降低了37%和33%，與陽性對照組基本相當。由此可知，MPS和BG對減小負重游泳小鼠的肌肉損傷都有顯著效果且存在顯著的劑量效應。水提物組和MPS+BG組的LDH活力沒有顯著性差異。

圖4 各灌胃劑量對負重游泳小鼠LDH活力的影響Fig.4 Effects of different supplementation on LDH activity in mice

2.3.3 丙二醛（MDA） MDA是油脂氧化的一種終極產(chǎn)物，當機體產(chǎn)生疲勞時，它的含量就會升高[17]。從圖5可以看出，各試驗組的MDA含量與空白組相比均無著性差異，且均顯著高于陽性對照組。結果表明：MPS和BG對負重游泳小鼠體內的MDA水平無顯著影響。

圖5 各灌胃劑量對負重游泳小鼠MDA的影響Fig.5 Effects of different supplementation on MDA in mice

2.3.4 超氧化物歧化酶活力（SOD） 前人研究表明高強度的運動會擾亂體內的抗氧化系統(tǒng)，而脂質的過氧化會影響細胞膜的流動性從而阻礙蛋白質等營養(yǎng)物質的傳輸，影響肌肉細胞的正常運作，導致疲勞產(chǎn)生[4，18]。而SOD活力反映了體內的抗氧化水平，所以通過測定SOD活力可以判定疲勞程度。從圖6可以看出，各實驗組的SOD活力與空白組相比都沒有顯著性差異，且均顯著低于陽性對照組。結果表明：MPS和BG對負重游泳小鼠體內的SOD活力無顯著影響。

圖6 各灌胃劑量對負重游泳小鼠SOD活力的影響Fig.6 Effects of different supplementation on SOD activity in mice

2.3.5 血尿素氮 （BUN） BUN是蛋白質和氨基酸的代謝產(chǎn)物，如果體內缺乏能量，蛋白質才會分解，從而導致體內BUN含量增加[19]。BUN也是疲勞的重要指標，當劇烈運動過后，BUN水平越高說明疲勞程度越大。如圖7所示，與空白組相比各試驗組的BUN含量都有顯著性降低，其中MPS高劑量組的效果最好，其含量比陽性對照組還要低19%，其余試驗組均略微高于陽性對照組。MPS的劑量效應顯著，而BG的劑量效應不顯著。水提物組和MPS+BG組的BUN含量沒有顯著性差異。

圖7 各灌胃劑量對負重游泳小鼠BUN的影響Fig.7 Effects of different supplementation on BUN in mice

2.3.5 肝糖原（LG） 眾所周知，在運動過程中能量供應不足會導致體力疲勞，若供能不足運動耐受力就會下降。運動所需的能量首先由肌糖原分解供給，當肌糖原消耗完畢之后由肝糖原補給能量[20]。換而言之，高LG儲備可以延緩疲勞。所以，LG含量也是跟疲勞相關的一項重要指標。從圖8可知，MPS高劑量組的LG含量組相比空白組顯著提高了65%，比陽性對照組提高了25%，而其他試驗組中小鼠的LG含量均略高于空白組且低于陽性對照組。在增加小鼠LG儲備方面，MPS具有顯著的劑量效應，BG的劑量效應不顯著。與之前的指標相似，水提物組和MPS+BG組的LG含量也無顯著性差異。BUN和LG作為與能量代謝相關的兩個重要指標，對比其測定結果可以看出，較高的LG含量對應的BUN含量較低。MPS在BUN和LG兩個指標的作用效果均顯著優(yōu)于BG和紅景天陽性對照物，由此可以推斷MPS是瑪咖水溶物提高能量儲備的主要作用物質。

圖8 各灌胃劑量對負重游泳小鼠LG的影響Fig.8 Effects of different supplementation on LG in mice

3 討論

抗疲勞物質的作用機制主要有加速致疲勞代謝產(chǎn)物的清除速率、增強機體對自由基的清除能力和抗氧化能力、提高LG儲備等。Mayumi等[12]研究發(fā)現(xiàn)BG可以通過提高脂肪酸作為能量的利用率，從而增強負重游泳小鼠的運動耐受力。而本研究還發(fā)現(xiàn)：MPS和BG均可以降低致疲勞代謝產(chǎn)物BLA的堆積，并有一定的劑量效應；MPS對儲備能量LG的積累有顯著的效果。沈維治等[21]通過給小鼠灌胃瑪咖粉（3 種劑量：1.0、0.3、0.03 mg/kg·d）證實了瑪咖的抗疲勞功效，并提出了MPS可能通過提高機體SOD活力、降低MDA含量、減少自由基的堆積、加速體內脂質過氧化物從而達到抗疲勞的效果的猜測。而本試驗結果顯示各組的該兩種指標均無顯著性差異，表明MPS和BG不能通過提高體內抗氧化活力而達到抗疲勞效果?，斂嵛锝M和MPS+BG組的各指標均沒有顯著性差異，瑪咖水提物組的劑量為 100 mg/kg·d，MPS+BG組的劑量為 25.3 mg/kg·d MPS+1.1 mg/kg·d BG， 此劑量設置基于本試驗所用的瑪咖水提物中MPS和BG的含量分別為25.3%和1.1%，由此能夠確定瑪咖水提物中的主要作用成分為MPS和BG。

結合抗疲勞活性物質的作用機制和本試驗結果可知：瑪咖的抗疲勞作用主要是通過減少乳酸堆積和增加肝糖原儲備來實現(xiàn)的，BG和MPS都具有減少乳酸堆積的作用，MPS在提高負重游泳小鼠的肝糖原儲備的作用顯著優(yōu)于BG，MPS是瑪咖水溶物提高肝糖原儲備的主要作用物質。本文雖然對BG和MPS的抗疲勞活性進行了研究，但是有關分子層面的抗疲勞機理仍需進一步探討。